土壤中抗生素抗性基因的分布及迁移转化

张 宁,李 淼,刘 翔 (清华大学环境学院,北京 100084)

抗生素被广泛用于预防由细菌感染引起的人类疾病以及促进养殖场畜禽的生长[1-2],然而研究表明用于医疗或者动物养殖的抗生素约有30%～90%以原药或者代谢物形式排出体[3],在环境中形成了一定积累[4],并对抗生素抗性的形成了选择压力,进而促进了抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes, ARGs)的产生和传播.而ARGs的传播引起的生态风险可能比抗生素更大.近年来,抗生素抗性作为一个重要的全球公共卫生问题受到越来越多的关注[5-6],并在2013年的 G8峰会上被确定为二十一世纪的主要卫生安全挑战[7].

目前已发现有40种四环素类ARGs,4种磺胺类ARGs和10种β-内酰胺类ARGs.抗生素抗性微生物(Antibiotic Resistance Microorganisms,ARM)死亡后,携带ARGs的DNA释放到环境中,在土壤矿物、有机胶体等的保护下可长期存在[8],不但可以通过水平基因转移(Horizontal Gene Transfer, HGT)的方式进入到其他微生物菌体或环境中[9],甚至能转移到人类共生微生物和病原体中[10].ARGs一旦产生就会在微生物种群中长期存在[11],可能对公共健康、食品和饮用水安全构成威胁,甚至出现无药可医的局面.

土壤被认为是抗生素残留的最重要的受纳体之一,抗生素残留和ARGs主要是通过施肥、污泥农用[12]以及废水或再生水灌溉[13]等方式释放到土壤中.目前关于土壤中 ARGs的研究主要集中在农田土壤施用粪肥后土壤 ARGs的丰度变化,废水灌溉后土壤ARGs的分布情况,以及外源汇入对土壤微生物的影响,并且多集中于少数种类的ARGs研究,而对于土壤物理、化学作用对ARGs的影响及ARGs在土壤中的迁移转化研究尚处于起步阶段,对于随粪肥或者污水进入土壤的重金属及其他物质对 ARGs的影响机制不明确.

事实上进入土壤的 ARGs不但可以通过植物吸收进入生物链,甚至还能通过渗漏进入地下水环境中,甚至很可能通过HGT以饮水与生物带入食物链的方式,在各个环境介质中传播转移,最后会进入人体.因此对土壤中 ARGs分布和传播的调查和深入研究刻不容缓.

1 土壤中ARGs的来源与分布

绝大多数用于治疗的抗生素来源于土壤微生物群落,可以说土壤是ARGs的主要来源之一.研究证明土壤中的ARGs丰度高且具有多样性,其来源分为本底存在和外源汇入两类.土壤本底抗性是指土著抗生素抗性菌(Antibiotic Resistance Bacteria, ARB)的基因组上存在 ARGs的原型片段以及没有表达的潜在ARGs片段;外源汇入是指受人类活动等因素的影响,由外源携带进入土壤环境.

1.1 土壤中ARGs的本底抗性

各种各样的ARGs都可以找到携带的微生物,这些微生物居住在不受人类影响的各种生态环境中.D'Costa等[14]应用宏基因组学的方法研究了加拿大Dawson城市30,000年前的永久性冻土,分别检测出了β-内酰胺类、四环素类和糖肽类ARGs的基因序列;Allen等[15]在未有人类活动的Alaskan土壤中发现了β-内酰胺抗性基因.研究人员对西藏地区没有人为抗生素干扰的土壤,动物废弃物和沉积物的分析也发现了不同类型的ARGs和可移动遗传因子(Mobile Genetic Elements, MGEs),此外还发现西藏环境中的ARGs小部分由MGEs携带[16].对新墨西哥州被隔离了400万年的Lechuguilla Cave中可培养微生物的研究也表明,这些微生物高度耐受抗生素,其中有些菌株甚至可耐受 14种不同的抗生素[17].都说明了早在抗生素广泛应用前,土壤环境中就存在ARGs.

1.2 人类活动对土壤ARGs的影响

与相对原始的ARGs相比,自人类广泛使用抗生素以来,当代人为干扰环境中的ARGs和MGEs已经发生了相当大的变化.

在抗生素被广泛应用的 70a间,人类活动加速了 ARGs在土壤环境中的分布和传播,主要可归纳为两个方面:肥料施用以及废水或再生水灌溉回用.城市生活污水和垃圾渗滤液由于受到人类生产生活的影响,被认为是抗生素残留以及ARB的重要储存库[18].医疗废水中残留的抗生素对 ARGs的产生也具有一定的诱导作用,并且人类服用抗生素之后也有可能会在体内诱导出ARB,这些ARB同样会随粪便排入医疗废水,因而大大增加了医疗废水中ARGs的丰度[19].不论是城市生活污水还是养殖场废水,或者医疗废水,最后都会进入污水处理厂,然而研究发现污水处理厂现行的处理工艺对抗生素及ARGs的去除效果并不高[20],经过处理之后的再生水通过回灌进入土壤.另外畜禽粪便、剩余污泥还可以通过堆肥,以肥料的方式进入土壤,造成土壤中抗生素和ARGs的累积.

对美国Cache La Poudre River五个不同污染程度的区域(无污染区、轻型农业活动污染区、城市污水排放区、农业活动严重污染区、城市和农业混合污染区)的抗生素抗性表型及ARGs的研究结果发现受人类干扰区域的四环素类及磺胺类 ARGs水平明显高于未受干扰区域[21].

1.2.1 不同来源ARGs对土壤ARGs的影响 养殖场由于长期使用抗生素作为饲料添加剂以及预防畜禽疾病,其畜禽粪中ARGs种类多种多样,有人对国内3个大型养殖场的取样测试发现场地土壤中有149种ARGs被检出[22],因此畜禽粪的处理和处置均能影响土壤中抗性水平.

多项研究表明,猪粪肥的施用显著提高了土壤微生物对四环素和磺胺类抗生素的抗性[23-25].对北京 9个长期施用畜禽粪肥的蔬菜生产基地土壤样品的检测也发现,四环素、氨苄西林、环丙沙星以及磺胺甲恶唑耐药菌比例远高于不施肥土壤,且施肥土壤中sul1和sul2以及tetL的检出率为100%[26].可能是因为磺胺类和四环素类抗生素是养殖业中常用的抗生素种类,而我国兽药抗生素中四环素的生产和使用比例最大[27].畜禽粪肥的施用还可能引起土壤微生物特定种群丰度的增加[28].对施用猪粪肥的玉米根际和非根际土壤的微生物群落检测发现,根际土壤中sul1和sul2丰度比非根际土壤中丰度低1～2个数量级[29],图1总结了粪肥施用对土壤及根际群落结构的影响[30].

然而也研究发现粪肥施用导致的土壤 ARGs增加不会长期维持,施用猪粪肥的土壤在21d和6个月后分别对磺胺氯哒嗪和四环素的抗性回到原始水平[23-24].但是来自粪便细菌的ARGs通常位于整合子,转座子和插入序列等元件上,这些元件可以通过广宿主质粒等接合元件有效地转移到土壤细菌中[31],从而引起土壤中ARGs丰度的增加.目前多数研究都集中于施用粪肥前后土壤微生物的监控而很少有研究指出施肥过程、土壤质地、土壤动物以及种植的作物种类对ARGs丰度变化的影响.

污灌对于土壤中的ARB和ARGs的影响也多有报道,对北京和天津的5个污灌区的污水灌溉和非灌溉土壤的抗生素、ARB以及ARGs丰度进行检测,发现污灌土壤中抗生素的浓度和 ARGs的丰度显著增加[7].对不同灌溉方式下不同性质土壤中 ARB和ARGs的丰度变化研究表明,使用再生水灌溉的土壤要比清水灌溉的土壤有着更高的抗性水平[32].

以畜禽养殖废水为例,其中ARGs的分布表现为tetQ、tetM、tetW、tetO的检出频率和丰度均高于其他类型的四环素类ARGs,其次为sul1、sul2和sulA[33].现有关于污水灌溉对土壤 ARGs的影响研究也多集中于少数几种常见的四环素和磺胺类 ARGs的变化而对于长期利用再生水灌溉引起的土壤中 ARB和ARGs变化的研究较少,关于再生水灌溉对根际土壤和非根际土壤中ARGs的研究还未知,事实上再生水回灌可能是ARGs进入土壤的重要途径之一.

图1 粪肥施用对土壤和根际微生物群落结构和功能的影响[30]Fig.1 Effects of manure that contains antibiotics on the structure and function of bacterial communities in soil and rhizosphere

表1 不同国家地区土壤ARGs或ARB的存在状况Table 1 Distribution of ARGs & ARB in different countries and regions

除此之外,土壤环境中质粒和其他 MGEs的稳定 性受到土壤类型,土壤养分,湿度,温度,以及pH值等的影响[34-35].因此在考察外源汇入对土壤 ARGs的影响过程中,多种因素的联合作用需要更加深入的研究.1.2.2 不同土壤类型中ARGs的分布 目前,在不同国家和地区的不同土壤样品中均有ARB及ARGs的检出报道,不但包括养殖场内部土壤,施用粪肥的土壤以及污水灌溉土壤,还包括各类河流表层土,冲积土以及未施肥的农田种植土.下表中列出了各类土壤中ARB和ARGs的存在情况.

2 ARGs在土壤环境中的转移传播

ARGs作为一种新型污染物,其在环境中的传播扩散受到越来越多研究者的关注,因此在评估土壤ARGs的生态影响时,不应该忽视外源 ARGs在土壤环境中的扩散以及其在种内和物种间水平上的基因交换.

图2 外源ARGs进入土壤环境甚至人体的途径Fig.2 The way of exogenous ARGs entering into soil environment and even human body

如前所述,生产生活废污水都会进入污水处理厂,经过处理之后再排入环境中,进入环境中的ARGs可以在各介质中传播扩散,并最终进入到土壤环境中,并有可能通过食物链进入人体,如图2所示.

2.2 土壤中ARGs的转移传播

ARGs在土壤中的传播是一个复杂的过程,ARGs不仅可以通过物理方式在空间上传播,如:风力,水流等自然外力;蚯蚓,线虫等土壤动物的携带等都为ARGs的传播提供了便利的条件[39];而且还能通过遗传或基因转移在微生物间转移传播,其方式包括基因垂向转移(Vetical Gene Transfer, VGT)和水平转移(HGT).VGT是指亲代和子代之间,通过繁殖发生的基因转移,传播范围有限.HGT是指在差异生物个体之间,或单个细胞内部细胞器之间所进行的遗传物质的交流.其中差异生物个体可以是同种的但含有不同遗传信息的生物个体也可以是不同种的生物个体[46].由于 HGT可以在同种或不同种属的菌株间发生传递,因而大大加速了ARGs出现的几率.携带ARGs的裸露DNA在一定的环境条件下能使ARGs转移进入受体细胞,受体细胞中的遗传物质又可以通过载体(如质粒)、直接(如接合)或者间接(如转化)的形式进一步转移[47],从而实现ARGs的扩散转移.

转化、转导和接合被认为是 HGT的主要方式[48].如图3所示,转化依赖于质粒或者细胞死亡后主动外排的染色体DNA片段,并且需要一个具有摄取胞外DNA能力的受体,完整的转化还依赖于受体的宿主细胞含有 DNA修复酶(重组酶),通过同源重组或者异常重组完成转化过程.转导是通过噬菌的作用转移基因的过程,噬菌体在宿主体内自我复制的过程中可以将宿主的遗传物质转移到新的宿主体内,或者将噬菌体吸附位点附近的DNA转移到新的宿主体内.接合的产生则是供体菌和受体菌通过抗性菌毛相互连接形成通道,DNA片段进入受体菌 的过程[49].

图3 抗生素抗性基因水平转移机制[48]Fig.3 The horizontal transfer mechanism of antibiotic resistance genes

2.2.1 土壤中ARGs的水平基因转移 HGT被认为是ARGs在土壤中传播扩散的主要原因,因为进入土壤的外源微生物并不能很好地适应新环境,然而HGT却可以使得进入到土壤中 MGEs在土著微生物间转移传播,因而在土壤中长期存在.

目前关于ARGs在土壤中HGT的研究还主要集中于MGEs携带的ARGs的转移.其中,抗生素抗性质粒被认为是ARGs水平转移的重要载体元件,在土壤抗性传播扩散中起到重要作用[50].通过基因组 DNA的PCR和杂交技术在猪粪中发现了81个质粒,并在这些质粒上检测到了阿莫西林、磺胺类 ARGs[51].耐药质粒通常通过接合或转化的方式在土壤细菌间传递 ARGs.对含有绿色荧光蛋白标记的广宿主质粒RP4供体菌在土壤细菌悬浮液中的转移研究发现,ARGs的转移率可达到1次/104土壤细菌转移,能接受该种质粒ARGs的受体菌包括属于α-变形菌,β-变形菌和γ-变形菌类的细菌变形菌[52].

转化是ARGs转移的另一个重要机制,其中转座子具有广宿主性,能在革兰氏阴性菌和阳性菌之间传播,既可以存在于质粒上又可以存在于染色体上.de Vries等[53]的研究表明,至少有87种细菌可以通过自然转化吸收胞外游离的 DNA并发生水平转移,包括假单胞菌和不动杆菌等菌属.还有研究指出,ARGs可以在土壤微生物和农作物之间发生转移[54].对 11个肉鸡饲养场的多种 ARGs的检测发现,磺胺类 ARGs在11个养殖场的所有样品中均有检出,并且sul1的浓度高于 sul2,可能是因为 sul1通常与整合子连接,较sul2有着更广泛的宿主范围[55].

《论语·泰伯》孔子云：“大哉尧之为君也！巍巍乎，唯天为大，唯尧则之。 荡荡乎，民无能名焉。 巍巍乎，其有成功也。 焕乎，其有文章。”[1]107 只有崇拜和赞颂。

另外ARGs也可以在土壤不同空间上发生转移,通过连续灌水的饱和土柱研究 ARGs的迁移特征以及转化效率发现,位于质粒pLEP01上的ARGs降解程度与其在土柱中的停留时间成正比,对 DNA的生物活性的测试表明,该活性与其降解后的剩余 DNA大致成比例,也就是说ARGs可以在水分饱和的土壤中运输相当长的距离[56].通过质粒在多孔介质填充柱的转移研究发现土著抗性质粒 pK5和工程质粒pBR322的转移运输过程类似,土壤中的土著质粒有可能长距离运输并导致抗生素抗性的扩散[57].

另外,养猪场附近典型土壤的土著细菌中发现了tetM,也表明了 ARGs有可能通过动物肠道菌株向土壤微生物传播[58].

2.2.2 土壤对携带ARGs的裸露DNA的吸附 携带ARGs细菌自身的代谢也是 ARGs转移的主要方式,ARB死亡后,细胞裂解将体内的抗性DNA分子释放到土壤,裸露的 DNA分子在环境中的持久性暴露也可能导致ARGs的水平转移[59],如图4所示.

DNA分子能够被土壤生物活性组分(土壤胶体)或者土壤粘土颗粒吸附,因此可以在一定程度上抵抗核酸的降解作用,有助于提高其在土壤中的转化能力和水平转移的频率.

然而,不同类型的土壤性质对ARGs的吸附和保留也有很大同[60].对不同农田施用猪粪和污泥后tetO、tetW及sul1的丰度变化的研究发现,壤土中3种ARGs的丰度均有增加,沙壤土却无明显变化[61].

事实上,不同土壤类型或者土壤成分对 DNA的吸附作用也不一样.在有机粘粒和蒙脱石上 DNA主要吸附的胶体表面上,靠静电力控制,容易被解吸;而在无机粘粒和高岭石上则通过配位交换和氢键连接,吸附在胶体边缘,不易被解吸. DNA在棕壤有机粘粒和蒙脱石表面对核酸酶有较强的抗性,而无机粘粒和高岭石表面固定的 DNA容易被降解,可变电荷的红壤中有机质和颗粒大小对 DNA降解的影响并不显著[62].说明吸附的 DNA抗核酸酶降解的能力不受DNA分子对胶体的吸附亲和力的控制.

图4 土壤环境中质粒的存在形式[59]Fig.4 The form of plasmid in soil environment

另外,环境pH值也可以影响土壤颗粒对DNA的吸附,pH从2.0上升到5.0,DNA在土壤胶体和矿物表面的吸附量明显降低,从 5.0到 9.0,吸附量缓慢降低;DNA分子在蒙脱石、高岭石和针铁矿上的吸附焓变随pH值的增加而增加,随着MgCl2浓度的增加而降低[63].

由于不同种类ARGs与土壤组分作用各不相同,并且土壤环境复杂,目前很难清晰地说明土壤理化特性对ARGs的影响,有待今后的深入研究.

3 影响ARGs在土壤中传播的因素

研究证明影响 ARGs在环境中传播转移的因素主要分为两个方面,一个是抗生素残留水平所产生的选择压力,另一方面是环境条件,主要包括光照、温度、pH值、重金属、有机物质等.

3.1 抗生素

一般认为,抗生素的使用和处置对ARGs以及传播具有一定的选择压力[64].抗生素自身在环境中的分布、迁移在很大程度上与其所诱导的 ARGs具有一致性,其浓度与ARGs的相对丰度之间存在一定的相关性[21,65],环境中抗生素的浓度大于最小抑制浓度(MIC)时,即被认为是强选择压力.亚治疗浓度的抗生素(通常为MIC的几百倍)水平也可以使环境中ARB增殖,可见抗生素残留是环境中 ARB繁殖和传播的重要原因.

3.2 重金属

大量研究表明,介质中重金属的存在对ARGs的诱导和激发也起到一定作用.通过研究猪粪、施肥土壤及对照土壤中8种ARGs,7种重金属及6种抗生素的存在水平,发现一些ARGs与某些重金属之间存在显著相关性,如sul3,sulA与铜、锌、汞之间的相关性系数均在 0.8以上[66].也有研究发现用硫酸铜处理过的土壤中的 ARM 显著增加[67],在实验室条件下研究Zn对镇江桑树圃的土壤ARGs水平基因转移的影响发现高浓度的Zn可以促进氨基糖苷类ARGs与转座子和整合子丰度的上升,有利于MGEs介导的ARGs发生转移[68].都说明了重金属对ARGs的产生及传播有共选择性作用.

3.3 有机物

除了抗生素、重金属之外,还有很多有机物质被认为是ARGs的诱导因子,这些物质多数有抗生剂的功效,被广泛地应用于农药和个人护理品,在环境中的检出量高出抗生素几个数量级,有可能成为 ARGs的潜在诱导因子[69].

另外,研究发现离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])可以通过抑制基因 korA、korB和 trbA的 mRNA表达水平来提高大肠杆菌E.coli DH5α的同属和跨属的接合转移,并通过增强kilA和kilB的mRNA的表达水平抑制垂向转移[70].

3.4 其他环境因素的影响

一些环境因素也成为ARGs转移的驱动力,如土壤含水量,环境温度,pH,离子强度等.

以色列再生水滴灌场地研究发现直接滴灌点的土壤中ARGs明显高于 50cm远的土壤,推测含水率较高的土壤中有较高的微生物活性,促进了ARGs的水平转移过程[32].Trevors 等[71]发现培养基中的R质粒在30℃和22℃时,发生了转移,但在15℃时,未发生转移.说明温度会影响质粒的转移过程.另外,二价离子相较于一价离子更能促进DNA在土壤矿物表面的吸附[63].

此外环境中的营养元素(如碳源、氮、磷等)对ARGs的转移也有显著影响.添加葡萄糖、α-乳糖能将城市污水中ARGs的水平转移频率提高了1-4个数量级,而添加氮和磷也能显著提高转化结合子的数量[72].

4 结语

我国作为抗生素的生产和使用大国,环境中ARGs的污染不容忽视.ARB和ARGs不但可以随施肥或者入渗进入土壤,通过 HGT在不同物种及环境间转移.而且随着微生物的不断进化,新的抗生素抗性机制也可能会随之产生[66].ARGs在土壤中的分布特征、行为机理及传播扩散等研究工作尚处于起步阶段.目前不仅对随肥料施入土壤的外源ARGs对土壤ARGs的影响作用机制不明确[67],而且土壤理化特性对ARGs赋存的影响也不清楚,因此对土壤中ARB和ARGs的分布规律及转移传播特性亟需深入研究.

(1)开展典型污染场地定点调查,全面掌握 ARGs的分布规律,污染程度,追踪污染源,为 ARGs环境污染评价指标提供相应的数据参考,为建立相应的环境标准提供理论依据.

(2)从前期预防,过程控制和末端治理同时入手深入研究ARGs在不同土壤环境中的迁移转化规律,以及影响其迁移转化的环境因素,探讨ARGs转移传播过程中的关键制约因子,建立相应的数量关系,为预测和防治土壤ARGs污染提供科学的基础数据.

(3)积极开展ARGs环境污染风险评价工作,开展ARGs的生态毒理研究,建立完善的 ARGs安全评估系统,对保障人类健康和生态环境安全具有重要的现实意义.