b型流感嗜血杆菌多糖与肺炎球菌表面黏附素A结合疫苗的免疫原性及预防急性中耳炎效果的实验研究△

陈泽宇 徐江红 郭蓉 邱创钧 陈兵

急性中耳炎(acute otitis media, AOM)是儿童常见的细菌感染性疾病之一，尤其是6～18个月的幼儿，而中耳炎及其并发症将不同程度地引起儿童听力障碍，这将可能严重影响幼儿的语言发育和认知能力。在临床上中耳炎也是使用抗生素治疗的主要疾病之一。近年来由于抗生素的大量使用甚至滥用，耐药菌株明显增多，抗生素耐药现象日趋严重。为了减少抗生素的使用，降低中耳炎尤其是儿童中耳炎的发病率，运用疫苗进行免疫预防愈发重要。国外已有相关疫苗用于预防中耳炎的报道[1]。据国外文献[2]报道，肺炎球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌是AOM的前3位主要致病菌。国内近期相关流行病学调查亦显示肺炎球菌是儿童AOM的主要致病菌之一。研制针对这些主要致病菌的疫苗，将在预防AOM的发病方面起到至关重要的作用。本研究旨在研制能同时针对中耳炎2种主要致病菌又适用于婴幼儿免疫的结合疫苗，即以肺炎球菌表面黏附素A(pneumococcal surface adhesin A，PsaA)为蛋白载体，和b型流感嗜血杆菌(hemophilus influenzae b，Hib)多糖结合的疫苗，达到预防2种细菌感染的作用。本研究在该类疫苗前期研究的基础上，进一步通过动物实验验证其免疫原性和对AOM的免疫预防效果。

1 材料与方法

1.1 材料 菌种：14型肺炎球菌(中国医学细菌保藏管理中心，产品编号31226)。

主要试剂：Hib多糖(武汉生物制品研究所)，PsaA(鼎泰海规生物科技有限公司)，辣根过氧化物酶羊抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)(ab97240，上海聚仕隆生物科技有限公司)，己二酸二酰肼(adipic acid dihydrazide，ADH)(Sigma公司)，溴化氰(cyanogen bromide，CNBr)(J&K公司)，乙二胺四乙酸(ethylen diamine tetraacetic acid，EDTA)(Sigma公司)。

主要设备：洗板机(Biotek 公司)，酶标仪(Bio-Rad公司，型号：680)，自动电位滴定仪(瑞士万通公司)，AKTA层析系统(GE公司)。

实验动物：约3周龄无特定病原体(specific pathogen free，SPF)雌性SD大鼠30只，体重88～102 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海市公共卫生临床中心实验动物部SPF级实验室。

1.2 方法

1.2.1 PsaA与Hib多糖的偶联结合 利用酰胺缩合法制备多糖与蛋白的结合物。将10 mg/mL Hib多糖用CNBr活化，以ADH为连接剂,活化后的Hib-ADH和PsaA以1 ∶1比例进行结合，以碳二亚胺为偶联剂，在碱性条件下进行反应；所得结合物用Sephrose 4FF层析柱纯化，于206 nm和280 nm双波长处监测并收集相应洗脱峰处的洗脱液，除菌过滤后即为Hib-PsaA结合物。

1.2.2 结合物中蛋白与多糖含量的定量测定 结合物中PsaA蛋白浓度测定采用改良 Lowry 法，Hib多糖含量测定采用改良钼酸铵测定法；结合物中游离多糖含量测定采用脱氧胆酸钠沉淀法。

1.2.3 PsaA-Hib多糖结合疫苗免疫原性分析 将幼龄雌性SD大鼠30只运用随机数字表进行随机区组分成2组：实验组15只，接种Hib-PsaA结合疫苗(疫苗中Hib多糖浓度为31 μg/mL)；对照组15只，作为空白对照，接种磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)。

实验组免疫接种Hib-PsaA结合疫苗，于大鼠大腿根前内侧皮下注射，每2周接种1次，每次接种0.5 mL(含Hib多糖 15.5μg)，共免疫3次。对照组接种PBS，接种方法同第1组，每次接种0.5 mL，共接种3次。

2组大鼠第3次接种后2周行眼眶采血，以离心机分离出血清，置于4 ℃下保存待测。

1.2.4 免疫动物血清抗PsaA抗体及抗Hib多糖抗体IgG的检测 采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)间接法测定各组大鼠血清抗Hib及抗PsaA抗体IgG滴度。

1)酶标板包被抗原及封闭。包被：分别以Hib-牛血清白蛋白溶液及PsaA溶液包被酶标板。封闭：将包被板进行洗涤，并加入封闭液，再洗涤，拍干待用。

2)样品ELISA检测。

(1)样品稀释和加样。将各组血清样品以1 ∶50稀释，然后按倍比稀释法稀释加样。空白对照组加入稀释液100 μL，其余各步骤相同。各取100 μL加入抗原包被过的酶标板中，置于37 ℃孵育60 min。

(2)洗涤、加酶、显色。采用洗板机清洗、拍干，再加入羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)，置于37 ℃孵育30 min，清洗、拍干后加入显色液，37 ℃避光显色10 min后每孔加终止液。

(3)测定。设定酶标仪波长为450、630 nm，用空白孔调零点后测定各孔光密度值。

1.2.5 肺炎球菌对免疫后大鼠中耳的攻击试验 攻击试验于上海市公共卫生临床中心动物实验部生物安全二级实验室(ABSL-2)中进行。

1)大鼠中耳内注射肺炎球菌。选择免疫接种的幼龄大鼠，于末次免疫后2周进行中耳细菌攻击试验。具体方法如下：大鼠以氯胺酮(60 mg/kg)+甲苯噻嗪(6 mg/kg)腹腔注射麻醉，以75%乙醇消毒耳部，在手术显微镜下分别于双耳以微量注射器经鼓膜穿刺向中耳内注入14型肺炎球菌悬液，浓度5.3×109CFU/mL (CFU为菌落形成单位)，每耳注入20 μL。

2)大鼠中耳标本组织病理学分析比较。首批于细菌攻击后3 d，实验组和对照组大鼠各取5只，断头，取出听泡，以4%多聚甲醛固定，再置于10%乙二胺四乙酸脱钙2周。制作石蜡包埋切片，作苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色。显微镜下作组织病理学观察分析。

第2批于细菌攻击后7 d，实验组和对照组大鼠再各取6只，断头，取出听泡。其余操作同首批标本。

1.3 统计学处理 以统计软件SPSS 11.5对2组大鼠血清的抗体滴度行对数转换后作均数的单因素方差分析检验。

2 结果

2.1 PsaA蛋白与Hib多糖偶联结合 运用酰胺缩合法成功将PsaA蛋白与Hib多糖偶联结合。结果显示，PsaA蛋白经Sephrose 4FF层析柱的层析收集峰值在130 mL左右(图1)，结合物的层析收集峰值在58 mL左右(图2)。因结合物分子量增大，使峰值明显前移，提示结合成功。

图1. PsaA经Sephrose 4FF层析柱层析的结果

图2. PsaA与Hib多糖结合物经Sephrose 4FF层析柱层析结果(红色曲线) 58.06 mL处的收集峰为结合物峰

2.2 结合物蛋白与多糖的定量测定及结合物回收率 PsaA-Hib结合物中多糖含量为31 μg/mL，蛋白含量为42 μg/mL，多糖/蛋白含量比为0.74。

2.3 结合疫苗免疫幼龄大鼠后血清相关抗体检测 免疫后各组大鼠血清抗PsaA抗体滴度及抗Hib抗体滴度检测结果见表1。抗体滴度读数的确定以ELISA中PBS作阴性参照。

表1 免疫后各组大鼠血清抗PsaA抗体及抗Hib抗体滴度及几何平均滴度(GMT)

先对抗体滴度作对数转换，然后运用两样本均数差别的方差分析法作统计学分析。结果显示：抗PsaA IgG滴度在实验组与对照组间差异有统计学意义(F=147.93，P<0.001)；抗Hib IgG滴度在2组间差异具有统计学意义(F=279.30，P<0.001)。

2.4 攻击试验 实验组和对照组大鼠在肺炎球菌中耳攻击后第3天和第7天中耳组织炎症反应情况的病理组织学检查结果见图3～4。

1)细菌攻击后3 d，实验组大鼠中耳炎症反应轻微；对照组大鼠中耳炎症反应较重，可见组织细胞水肿、间质充血、炎细胞浸润明显(图3)。

2)细菌攻击后7 d，实验组大鼠中耳炎症反应较轻，见轻度充血，水肿不明显；对照组大鼠中耳炎症反应重，可见组织细胞肿胀变性、炎细胞浸润进一步加重(图4)。

图3. 实验组(A)和对照组(B)大鼠经细菌攻击3 d的中耳组织 (HE染色×50)

图4. 实验组(A)和对照组(B)大鼠经细菌攻击7 d的中耳组织(HE 染色 ×50)

3 讨论

由于儿童咽鼓管解剖结构的特点及免疫系统发育不完善、抵抗力弱等因素，AOM在儿童尤其是3岁以下幼儿中发病率甚高，且易反复发作，给儿童带来听力障碍及由此产生的语言及认知发育等影响。曾有学者报道，70%～90%的儿童6岁前至少有1次中耳炎发作[3]，在3岁以下儿童中患过AOM者高达75%[4]。在临床上中耳炎也是使用抗生素治疗的主要疾病之一。近年来由于抗生素的大量使用甚至滥用，耐药菌株明显增多，临床常用抗生素的高耐药率已不容忽视[5]。为了减少抗生素的使用，降低中耳炎尤其是儿童中耳炎的发病率，使用疫苗预防和治疗AOM是极好的方法和重要的手段[6]。国外几年前已有疫苗预防中耳炎的临床应用报道，而国内尚罕见预防中耳炎的疫苗用于临床的研究报告。

肺炎球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌是AOM致病菌的前3位主要病菌，据国外文献[7]报道，这3种病菌分别占40%～50%、20%～30%和10%～15%。国内近年的相关研究显示，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌是AOM的最主要致病菌[5]。因此，研制并应用针对这几种致病菌的疫苗，将可在预防AOM的发病方面起到至关重要的作用。目前国外已经用于临床针对AOM的疫苗主要有多价肺炎球菌多糖疫苗和肺炎球菌多糖与其他细菌蛋白结合疫苗[8-9]。但有如下不足：①多糖疫苗只能引起非胸腺依赖性免疫应答，对于免疫系统发育尚不成熟，仅可诱发胸腺依赖型免疫反应的婴幼儿来说作用甚微；②疫苗的抗原成分肺炎球菌多糖具有型特异性，仅对疫苗所包含的肺炎球菌多糖亚型有效。由于肺炎球菌的荚膜多糖具有90多个血清型，以肺炎球菌荚膜多糖为抗原制备的疫苗接种所产生的抗体具有型特异性特点，只对所包含多糖血清型的肺炎球菌具备免疫保护作用[8]。但不同的国家和地区其主要的致病血清型是不尽相同的，同一个地区随着时间的变化其致病血清型也会发生变化[10-11]。Fletcher等[12]总结了5个关于肺炎球菌多糖与白喉毒素蛋白或脑膜炎奈瑟菌蛋白结合疫苗的临床试验结果发现，疫苗对减少AOM的发作，尤其是AOM的复发是有效的，但主要是对疫苗所包含的肺炎球菌血清型所致的AOM有效，有效率约60%，而对所有AOM的有效率则为0～34%，可见肺炎球菌多糖作抗原的结合疫苗的局限性。PsaA、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌溶血素作为肺炎球菌的主要抗原蛋白，具有免疫原性，它们的特点是在各种多糖血清型的肺炎球菌之间具有交叉免疫保护作用[13]。PsaA为肺炎球菌表面结合脂蛋白，在肺炎球菌黏附呼吸道黏膜过程中起关键作用。PsaA是各型肺炎球菌共有的一种遗传保守的、种特异性的表面蛋白抗原，具有较好的免疫原性。有学者[14-15]报道，PsaA是降低肺炎球菌在机体呼吸道上皮寄生主要的抗原蛋白。由于各种血清型的肺炎球菌PsaA是相同的，本研究以肺炎球菌抗原蛋白PsaA作为结合疫苗的成分之一，将有可能激发机体产生对各种血清型肺炎球菌感染均有预防作用的抗体，且其另一抗原成分为Hib多糖，因此结合了AOM 2种主要致病菌的抗原，有望在预防AOM的发病方面发挥优势。同时，作为多糖蛋白结合疫苗，其对幼龄个体AOM的好发人群即2岁以下婴幼儿同样有效。随着肺炎球菌疫苗应用的逐渐推广，流感嗜血杆菌导致的AOM比例有增高趋势[16]；因此，疫苗中包含针对流感嗜血杆菌的抗原成分显得日益重要。

作者在前期的研究中已应用基因工程技术成功制备PsaA，并且也已摸索出细菌荚膜多糖和蛋白结合制备结合疫苗的技术[17-18]，为本项目流感嗜血杆菌多糖与PsaA的结合疫苗研究奠定了基础。前期研究已成功地将Hib多糖与PsaA蛋白交联结合，并在幼龄小鼠体内诱导产生有效的免疫反应[18]。本研究进一步优化和完善了Hib-PsaA结合疫苗制备的实验方法和条件，并在幼龄大鼠体内诱导产生了有效的免疫应答，通过肺炎球菌的中耳攻击试验显示出其对AOM有效的免疫保护作用，再次证明所研制的新型疫苗对幼龄个体有较好的免疫原性。

本研究中细菌攻击试验结果显示，在攻击后第3天，实验组大鼠的中耳炎症反应程度轻于对照组，这种差异在攻击后第7天更趋明显。此现象表明，接种本研究研制的疫苗，能使幼龄大鼠有效抵御肺炎球菌感染后产生的中耳炎症反应。

我们期望在取得此新型结合疫苗实验研究的成功之后能进一步走向临床应用试验阶段，并最终用于婴幼儿和其他易感人群，以大幅降低AOM的发病率，以期取得显著的社会效益和经济效益。