活血生肌汤联合干细胞移植干预糖尿病足作用的临床研究❋

李高申，郭梅珍，牛美兰，何雄文

(1. 黄河科技学院医学院，郑州 450063； 2. 河南省中医药研究院附属医院，郑州 450006)

糖尿病患者发生糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers，DFUs)的概率一生中高达25%，这些患者中有14%～24%的人群最终需要接受截肢治疗[1]。目前糖尿病足的治疗有溶栓、抗凝、扩血管、介入、血管搭桥、清创、截肢手术等，其治疗疗程较长、费用高且疗效不理想，因此临床急需寻求一种全新的治疗方法或手段。近年来，干细胞移植治疗下肢缺血病得到临床认可。干细胞可以在体内分化为血管内皮细胞和平滑肌细胞，分泌促血管生成因子，逐渐分化并形成新生毛细血管，改善和恢复缺血下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的[2]。

本研究应用自体骨髓血干细胞移植法治疗糖尿病足溃疡，观察和评估干细胞移植后患者的肢体下肢血流图及疼痛、皮肤温度、静息痛、跛行距离、踝肱指数和溃疡愈合率的改善情况，并观察联合应用活血生肌汤对糖尿病足相关指标的变化，探索糖尿病足治疗的有效方法和途径。

1 资料

1.1 一般资料

表1显示，选取2015年1月至2016年10月河南省中医药研究院附属医院内分泌科收治糖尿病足溃疡患者60例，在获得医院伦理委员会批准后(QXCRF2015-011)，每位受试者签署知情同意书后实施。按照治疗方式的不同分为常规内科治疗组(简称常规治疗治)、常规内科治疗组+干细胞移植(简称干细胞移植组)、干细胞移植+常规内科治疗+活血生肌汤联合治疗组(简称活血生肌汤组)3组。3组受试者基础指标比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

表1 各组患者基础资料比较(±s，mmol/L)

表1 各组患者基础资料比较(±s，mmol/L)

组别例数男/女年龄/岁病程/年糖化血红蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖P值常规治疗组207∶862.20±4.575.86±2.998.15±1.408.19±1.0013.20±3.76>0.05干细胞移植组208∶763.71±5.446.07±2.418.22±1.197.34±2.5213.35±2.76>0.05活血生肌汤组208∶763.61±5.426.11±1.238.19±1.007.35±2.5313.29±2.76>0.05

1.2 诊断标准

糖尿病西医诊断标准参照《糖尿病肢体动脉闭塞症诊断及疗效标准》(草案)[3]，中医诊断标准参照2007年中华中医药学会发布的《糖尿病中医防治指南》[4]。

1.3 纳入和排除标准

纳入标准：符合糖尿病足的诊断标准，参照《糖尿病肢体动脉闭塞症诊断及疗效标准》(草案)；中医辨证为“气阴两虚，瘀血阻络”病证；下肢动脉血管造影(CT angiography，CTA)检查有肢体动脉狭窄闭塞性改变，以腘及腘动脉以远动脉病变为最多见；年龄50～75岁；踝肱指数(ABI)≤0.4；溃疡面积介于5～15 cm2。

排除标准：非2型糖尿病患者；50岁<年龄<75岁；不以膝下动脉病变为主的糖尿病足患者；踝肱指数(ABI)>0.4；对方案中使用的药物过敏者；合并严重心、肝、肾功能不全者；排除急性下肢动脉栓塞、多发性大动脉炎、血栓闭塞性脉管炎、雷诺氏病等其他缺血性疾病。

1.4 实验所需药物与器材

活血生肌汤组成：红花8 g，丹参13 g，生黄芪8 g，乳香25 g，党参17 g，川芎10 g，赤芍18 g，大黄8 g，黄柏5 g，生地黄8 g，由河南省中医药研究院附属医院中药制剂室制备(高压浓缩煎煮为200 ml药液)，分装2袋，每袋100 ml；肝素、利多卡因、精蛋白生物合成人胰岛素注射液等由医院药房提供。COM.TEC血细胞分离机(费森尤斯集团)；FACSCalibur流式细胞仪(上海碧迪医疗器械有限公司)；精密分析天平(上海第二天平仪器厂)；红外线皮温仪(意大利TECNIMED公司)；骨髓穿刺包(河南省中医药研究院附属医院)；多普勒血流探测仪及踝肱指数检查套件(日本株式会社Hadeco公司)；C02恒温孵育箱(德国Heracus公司)；BX41系统显微镜及照相系统(日本Olympus公司)；C1501DAB染色试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；超薄切片机(瑞士IMINA公司)；所有试剂(10%甲醛溶液、苏木素、伊红、25%戊二醛溶液、无水乙醇等)由河南省中医药研究院病理室提供。

2 方法

2.1 自体骨髓干细胞提取方法

依据常规术前准备所需药品、物品，手术中严格按照自体骨髓干细胞的分离、处理操作要求进行。

2.2 分组与治疗实施

将60例糖尿病足伴有下肢慢性缺血的患者按随机数字表法分为常规内科治疗组(常规治疗组)20例共26条患肢，常规内科治疗组+干细胞移植(干细胞移植组)20例共29条患肢，干细胞移植+常规内科治疗+活血生肌汤联合治疗组(活血生肌汤组)20例共28条患肢，常规治疗组患者从入院至随访结束统一行内科常规治疗：统一正规胰岛素制剂调血糖、氨氯地平胶囊降压、罗伐他丁降血脂、头孢哌酮钠舒巴坦钠抗感染、阿司匹林抗凝等药物治疗，溃疡局部行外科彻底清创换药，局部坏死组织行手术切除；干细胞移植组患者在行同常规治疗组内科治疗的同时，对于CTA检查血管闭塞者行自体骨髓血干细胞移植治疗；活血生肌汤组患者在常规内科治疗+自体的骨髓血干细胞移植的同时口服活血生肌汤100 ml/次，每日2次(10Am，8 pm)，2周为1个疗程，连用3个疗程。

2.3 疗效评价指标

2.3.1 主观指标 表2显示，疼痛、冷感采用评分表法将其量化。

表2 糖尿病足临床症状量化评分标准

2.3.2 溃疡愈合情况 观察溃疡面积、溃疡面愈合及溃疡面愈合率比较 治疗3个月后，观察患者血压、血糖、血脂、足趾皮温、跛行距离、踝肱指数(ABI)的变化情况，查间歇跛行患者无痛步行时间(min)、下肢动脉造影、实验室指标检测、病理学检测等。

2.4 效果评价

痊愈：创面完全愈合，临床症状消失；显效：肉芽上皮生长，创面面积缩小75%，临床症状有改善；好转：肉芽上皮生长，创面面积缩小25%，临床症状稍有改善；无效：肉芽上皮无明显生长或肉芽晦暗，创面面积缩小不足25%，临床症状无改善。愈合率=完全愈合例数/总例数×100%。

2.5 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，用L-SD，S-N-K进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 3组治疗3个月后疗效比较

表3显示，与常规治疗组比较，干细胞移植组和活血生肌汤组患者移植后的指标(血糖、静息疼、足冷感觉、间歇跛行、足趾皮温、踝肱指数)差异有统计学意义(P<0.05)；与干细胞移植组比较，活血生肌汤组患足间歇性跛行、足趾皮温、踝肱指数评分差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 糖尿病足患者治疗3个月后各项指标结果比较(±s, mmol/L)

表3 糖尿病足患者治疗3个月后各项指标结果比较(±s, mmol/L)

组别例数 糖化血红蛋白(%)空腹血糖餐后2 h血糖静息疼足冷感觉间歇间跛行足趾皮温踝肱指数P值常规治疗组207.42±1.616.95±1.6411.23±2.242.43±0.822.99±0.452.99±0.8531.88±1.190.41±0.24干细胞移植组 207.38±1.236.86±2.1210.10±1.281.38±0.73★ 2.22±0.79★2.22±0.79★32.99±1.33★ 0.55±0.33★<0.05活血生肌汤组 207.07±0.976.12±1.329.19±1.021.16±0.39 ★△ 1.44±0.64★△1.44±0.64 ★△33.66±1.46 ★△0.58±0.49★△<0.05

注：治疗3个月后与常规治疗组比较：★P<0.05，与干细胞移植组、活血生肌汤组比较差异有统计学意义；与干细胞移植组：△P<0.05与活血生肌汤组比较差异有统计学意义

3.2 3组治疗3个月后血压、血脂比较

表4显示，与常规治疗组比较，干细胞移植组、活血生肌汤组血压、TC、TG、LDL-C、HDL-C降低，差异有统计学意义(P<0.05)，HDL-C较常规治疗组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；活血生肌汤组TC、TG、LDL-C较常规治疗组明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，活血生肌汤组HDL-C较常规治疗组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

表4 治疗3月后3组血脂比较(±s， mmHg， mmol/L)

表4 治疗3月后3组血脂比较(±s， mmHg， mmol/L)

组别例数收缩压舒张压TCTGLDL-CHDL-CP值常规治疗组20135.27±17.1276.60±6.804.76±0.972.15±2.112.76±0.701.12±0.25干细胞移植组20136.25±22.32★72.32±16.74★4.63±0.92★1.95±1.83★2.71±0.81★1.17±0.39★<0.05活血生肌汤组20132.23±32.3471.21±12.304.56±1.33★★1.69±1.24★★2.71±0.63★★1.32±0.30★★<0.01

注：治疗3个月后与常规治疗组比较：★P<0.05,★★P<0.01，干细胞移植组、活血生肌汤组血压、TC、TG、LDL-C、 HDL-C比较差异有统计学意义， 活血生肌汤组TC、TG、LDL-C、 HDL-C差异有统计学意义

3.3 治疗3个月后溃疡面积及愈合率、创面肉芽组织中毛细血管数量比较

表5显示，3组治疗前对溃疡面积及愈合率、创面肉芽组织中的毛细血管数量比较差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3个月后，活血生肌汤组创面肉芽组织中毛细血管数量明显多于常规治疗组，差异有统计学意义(P<0.01)；活血生肌汤组多于干细胞移植组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 3组左侧患足溃疡面积/创面肉芽组织中毛细血管数量、愈合率比较 (±s，cm2)

表5 3组左侧患足溃疡面积/创面肉芽组织中毛细血管数量、愈合率比较 (±s，cm2)

组别例数治疗前溃疡面/毛细血管数量治疗3个月后溃疡面/毛细血管数量愈合率(%)P值常规治疗组2016.4±7.6/ 6.66±0.5216.35±2.51/11.7±0.250/20(0.00)>0.05干细胞移植组2017.0±7.5/ 6.85±0.601.45±1.86★/ 15.3±0.6613/20(65.00)★<0.05活血生肌汤组2017.5±7.8/ 6.75±0.560.22±0.68★★ / 22.0±0.6319/20(96.43)★★<0.01

注：治疗3个月后与常规治疗组比较:★P<0.05,★★P<0.01(干细胞移植组、活血生肌汤组的溃疡面/创面肉芽组织中毛细血管数量、愈合率比较差异有统计学意义，活血生肌汤组的溃疡面/创面肉芽组织中毛细血管数量、愈合率比较差异有统计学意义)；与干细胞移植组比较：△P<0.05(活血生肌汤组差异有统计学意义)

3.4 治疗3个月后选择3组血管显影典型病例比较

图1显示，常规治疗组治疗3个月后左膝下胫后动脉阻塞，干细胞移植组治疗3个月后左胫后动脉畅通，活血生肌汤组治疗3个月后血流直达左足部。

3.5 实验室指标

表6、7显示，患者治疗3个月前后左下肢腘动脉管径、足背动脉管径及血流速度、左下肢正中、腓神经传导速度进行比较。

图1 治疗3个月后常规治疗组、干细胞移植组、活血生肌汤组血管造影比较

组别例数治疗前/后腘动脉管径 治疗前/后腘动脉流速治疗前/后足背动脉管径治疗前/后足背动脉流速P值常规治疗组200.45±0.12/0.49±0.1346.25±5.32/48.96±4.260.24±0.02/0.27±0.0430.34±4.53/33.45±4.21>0.05干细胞移植组200.45±0.23/0.55±0.2246.42±4.42/62.43±4.210.24±0.02/0.40±0.1332.34±4.51/36.03±4.51<0.05活血生肌汤组200.44±0.22/0.96±0.2346.32±4.32/62.93±4.210.24±0.01/0.91±0.2332.24±4.41/36.03±4.51<0.05

表7 3组治疗前后左下肢神经传导速度变化比较(±s，mm/s)

表7 3组治疗前后左下肢神经传导速度变化比较(±s，mm/s)

组别例数治疗前/后正中神经传导速度 治疗前/后腓神经传导速度P值常规治疗组2045.43±1.26/45.67±1.7136.21±1.02/37.56±1.21>0.05干细胞移植组2044.45±1.01/56.36±1.2136.17±0.33/46.31±0.63<0.05活血生肌汤组2044.55±1.11/44.55±1.1136.27±0.43/47.81±0.73<0.05

注：常规治疗组2组比较差异无统计学意义(P>0.05)；干细胞移植组、活血生肌汤组2组比较差异有统计学意义(P<0.05)；干细胞移植组、活血生肌汤组治疗后的效果优于常规治疗组(P<0.05)，活血生肌汤组优于干细胞移植组(P<0.05)

3.6 组织病理学观察

图2、3显示，3组创面肉芽组织中毛细血管数量比较，治疗前3组创面肉芽组织中的毛细血管数量差异无统计学意义(P>0.05)；治疗3个月后，与常规治疗组比较，活血生肌汤组创面肉芽组织中毛细血管数量明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)；与干细胞移植组比较，活血生肌汤组差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组治疗前创面组织病理学观察(HE×200)注：3组创面肉芽组织中的毛细血管数量差异无统计学意义，P>0.05

图3 各组治疗3月后创面组织病理学观察(HE×200)注：活血生肌汤组创面肉芽组织中毛细血管数量较常规治疗组明显增多，P<0.01；但较干细胞移植组毛细血管数量增多，P<0.05

3.7 安全指标评价

活血生肌汤组1例患者轻微恶心、呕吐、腹痛，停用口服中药1周内症状消失；其余组干细胞移植治疗后精神、饮食、情绪、血、尿常规、心电图、肝肾功能、外周血象均无异常。

4 讨论

近年来，干细胞移植技术逐渐用于治疗下肢缺血，移植到缺血处的干细胞逐渐分化并形成新生的毛细血管，可改善和恢复下肢血液循环，达到治疗因糖尿病引起慢性下肢缺血的目的[5-6]。本次研究发现，自体骨髓干细胞移植组(活血生肌汤组、活血生肌汤组)治疗3个月后腘动脉管径、足背动脉管径较移植前宽，腘动脉及足背动脉血流速度较移植前快，正中神经、腓神经传导速度较移植前快，且干细胞移植组、活血生肌汤组治疗后下肢血流及神经传导速度的效果均优于常规治疗组，且干细胞移植组、活血生肌汤组患者干细胞移植治疗3个月后，左胫后动脉及左下肢动脉直达足底。本研究结果证实，自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足下肢缺血效果是很明显的。

干细胞移植之所以治疗下肢缺血有效，是因为自体骨髓干细胞移植可以分化成血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，直接形成新的血管；通过旁分泌形式生成多种血管生成因子，促进血管新生[7-9]；大量的动物实验表明，骨髓干细胞移植能促使缺血的后肢生成新生血管。2002年Tateishi Yuyama等首次应用自体骨髓干细胞移植治疗缺血性下肢血管病，取得了满意的疗效，且未发生明显的不良反应[10-12]。本次研究发现，干细胞移植组、活血生肌汤组干细胞移植治疗3个月后新生毛细血管数较常规治疗组多，且无不良反应。该研究结果与资料是一致的，证实了自体骨髓干细胞移植后糖尿病足溃疡新生血管的形成。

中医认为，糖尿病足是由于“气阴两虚，瘀血阻络”阻于四肢脉络，气血不能供养肌肉筋骨引起患肢的麻木疼痛或肢端坏疽。课题组认为，阴虚内热是糖尿病发病的根本，而瘀血内停为糖尿病足病因，瘀血内停、脉络血瘀滞流、闭塞不通导致下肢缺血坏死。本研究是在活血生肌汤具有改善糖尿病足下肢循环作用[13]的基础上，在自体骨髓干细胞移植的同时合用活血生肌汤治疗糖尿病足。

活血生肌汤方中的红花、丹参、赤芍具有活血化瘀、改善糖尿病下肢微循环、促进病变组织的修复与再生，协同党参、生黄芪、生地黄补气、养血生津、止血祛瘀生肌的作用，加之乳香、川芎的活血行气、解郁、通达、止痛之功效及黄柏的攻积滞、清湿热等均可治疗糖尿病足溃疡。本次研究结果不论从一般指标还是客观指标(血管显影、动脉管径、血流速度、神经传导、毛细血管数量等)变化情况均证实，活血生肌汤具有活血通络、祛瘀生肌、促进干细胞移植后血管新生、建立侧枝循环的作用，研究结果为糖尿病足的治疗提供了理论依据和方法。

本研究显示，自体骨髓干细胞移植技术治疗糖尿病足是有效的，活血生肌汤可以提高自体骨髓血干细胞移植技术的疗效。