固定化脂肪酶ANL非水催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯

徐文婷，毕武丹，丛方地,，于琬琪，张树林，杨 薇，罗 巍

(1.天津农学院 基础科学学院 生物制药系，天津 300384；2.天津农学院 水产生态及养殖重点实验室，天津 300384)

L-抗坏血酸(Vc)，是一种天然活性成分，是较强的抗氧化剂之一，对环境无毒无害，易被人体消化吸收，广泛用在医药、食品和化妆品等行业[1]。它不溶于脂质，稳定性差。然而，Vc酯化后，形成Vc脂肪酸酯，不但具有脂溶性[2]，而且抗氧化性和稳定性也显著提高[3]，另外还有抗癌作用[4]，是世界上公认的安全无害的营养添加剂[5]。

Vc酯的制备通常有化学合成法和生物酶催化合成法[6]。化学合成中，化学催化剂常带入有毒物质，需高温、高压条件，伴有副反应发生及毒副性产物和非自然异构体产生，还会严重污染环境[7-8]。酶法合成是利用脂肪酶，在有机溶剂中催化Vc与脂肪酸或其酯发生酯化或酯交换反应生成Vc脂肪酸酯，具有环境友好、催化效率高、副反应少、对设备要求不高、产品下游分离比较容易等优点[4,9]。但脂肪酶在有机相中不稳定，容易变性失活，且用于合成Vc酯的酶促反应温度通常高于50 ℃，此外，因反应体系中使用了过量的脂肪酸，容易影响产物的提纯及收率[4-6]。为提高酶非水相催化作用，通常制备固定化酶或酶生物反应器，以提高其非水催化能力[10]，其理论依据为脂肪酶的界面活化机制，即在水/油(有机相)上，水相优化稳定化酶蛋白，有机相激活酶活性中心[11]。对于酶促合成Vc酯的研究，已取得了一定的进展[5-10]，但在提高酶活性、产物提纯和降低催化温度等方面，还有待进一步的研究。

为此，本文中，笔者以界面活化机制为基础，选择玻璃器壁和脱脂棉为载体，将黑曲霉菌脂肪酶Aspergillusnigerlipase(ANL)分别固定在器壁和脱脂棉纤维上，制备出固定化酶(器壁-ANL和脱脂棉-ANL)，并用于催化Vc与棕榈酸发生酯化反应，研究酶促合成Vc棕榈酸酯的效果。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

黑曲霉脂肪酶(ANL，12 000 U/g，源于黑曲霉菌Aspergillusniger)，杭州创科生物科技有限公司；Vc、棕榈酸、甲醇，市售分析纯；高效液相色谱仪(HPLC，Agilent 1260 Infinity)，装配HyPURITY -C18柱；HNY-100B型恒温振荡培养器，天津市欧诺仪器仪表有限公司。

1.2 HPLC分析方法

取反应液2 μL，置于2 mL离心管内，敞口放置10 min。使溶剂丙酮挥发完全后加入1 mL流动相，溶解，过滤膜(0.22 μm)，HPLC分析。叔丁醇作溶剂时，取样后直接用流动相稀释，过滤膜，进行HPLC分析。检测波长254 nm，流速设为1.0 mL/min，进样量20 μL。测得的Vc积分面积(S0)和Vc棕榈酸酯积分面积(S1)用于计算反应的摩尔转化率(c)，c=[S1/(S0+S1)]×100%。

1.3 ANL 固定化

称10 mg ANL酶粉，加入10 mL棕色玻璃瓶中，再加0.2 mL蒸馏水，轻轻摇动，使ANL溶解。将玻璃瓶敞口，在160 r/min、37 ℃条件下保持8 h，得器壁-ANL。2 g脱脂棉先在100 mL乙醇中分别浸泡2次，每次24 h，取出后，待乙醇挥发完，取10 mg脱脂棉加入上述含ANL酶溶液的玻璃瓶中，充分吸附酶溶液，在上述同样条件下固定化，后用镊子将脱脂棉拉至蓬松，得脱脂棉-ANL。

1.4 丙酮中酶催化

称0.01 g Vc，加入50 mL棕色容量瓶中，分次加丙酮，并振荡，直至Vc全溶，定容至刻度，Vc质量浓度为0.2 mg/mL。称0.262 g棕榈酸加入100 mL容量瓶中，加丙酮，振荡，至固体全溶，定容至刻度，溶液质量浓度为2.62 mg/mL。在含有ANL酶粉、器壁-ANL或脱脂棉-ANL的棕色瓶中(ANL质量均为10 mg，下同)，加入上述Vc-丙酮溶液3 mL和棕榈酸-丙酮溶液1 mL(Vc和棕榈酸的摩尔比为1∶ 3)，盖盖，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反应，按设定时间取样分析。

1.5 叔丁醇中酶催化

在含器壁-ANL或脱脂棉-ANL的棕色瓶中，加入0.04 g Vc和0.18 g棕榈酸(Vc和棕榈酸的摩尔比约为1∶ 3)，再加入4 mL叔丁醇，盖盖，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反应24 h。按时取样分析。

1.6 底物等摩尔比的反应

在含器壁-ANL或脱脂棉-ANL的棕色瓶中，加入0.2 mg/mL的Vc-丙酮溶液3 mL和2.62 mg/mL的棕榈酸-丙酮溶液0.33 mL(Vc和棕榈酸的摩尔比为1∶ 1)，盖盖，并用封口膜封口，在160 r/min、37 ℃下反应24 h。按时取样分析。

2 结果与讨论

2.1 反应体系的HPLC分析结果

由于ANL酶的选择性[12]，酶促酯化反应在Vc的C6-羟基上优先进行(图1)。Vc在254 nm处有特征吸收[13]，以甲醇、水和微量冰醋酸组成流动相，在不同体积配比下，分析反应体系的组分。图2为两种固定化酶反应1 h后Vc和Vc棕榈酸酯的HPLC分析图。从保留时间、峰分离度及峰形等综合考虑，最佳的流动相配比为V(甲醇)∶V(水)∶V(冰乙酸)=75∶ 25∶ 0.1，Vc和Vc棕榈酸酯的保留时间分别为3.17和4.02 min。

图1 酶促合成Vc棕榈酸酯Fig.1 Enzymatic synthesis of Vc palmitate

图2 酶促反应1 h后Vc和Vc棕榈酸酯的HPLCFig.2 HPLC of Vc and Vc palmitate after enzymatic reaction for 1 h

2.2 ANL酶促酯化反应

为研究固定化酶的催化反应动力学，分别使用器壁-ANL和脱脂棉-ANL为催化剂，丙酮为溶剂，Vc与棕榈酸的摩尔比为1∶ 3[14]。在较温和的条件(37 ℃、160 r/min)下进行催化反应，反应动力学见图3。

图3 固定化ANL催化酯化动力学Fig.3 Kinetics of esterification catalyzed by immobilized ANL

由图3可知：在开始阶段，两种固定化酶的催化活性相近，但器壁-ANL活性较高；1 h后，器壁-ANL转化的底物相对较多；8 h后，相对于脱脂棉-ANL，器壁-ANL转化底物的能力有所降低；24 h后，二者催化反应的转化率分别为87.3%和90.4%。可见，脱脂棉-ANL的非水相催化活性更稳定些。而近似条件下，酶粉ANL催化反应24 h后底物转化率仅为36.3%(表 1)。两种固定化酶转化底物的能力都是酶粉的2倍多。说明玻璃和棉纤维都有利于提高酶的催化活性，玻璃壁为极性材料，容易与酶蛋白结合以稳定酶蛋白；脱脂棉为多羟基、大比表面积、柔性强、惰性且与蛋白有兼容性的天然材料[15]，这些特性类似水，有助于优化和稳定化酶蛋白。

2.3 溶剂和底物比对反应的影响

合成Vc棕榈酸酯时，为提高合成效果，通常以叔丁(戊)醇或丙酮为溶剂，反应温度定在50 ℃以上[16-17]。在较温和的条件(37 ℃、160 r/min)下，使用2种不同的溶剂，反应24 h，考察溶剂和底物比对反应的影响，结果如表1所示。由表1可知：叔丁醇为溶剂时，脱脂棉-ANL、器壁-ANL催化反应的转化率都较低，皆为18.5%。这可能是叔丁醇的分子结构中含有羟基的原因，虽然经过验证，它不参与反应[18]，但可能会干扰反应[10]；另外，叔丁醇熔点高，在37 ℃下比较黏稠，没有丙酮流动性好,不利于底物与酶蛋白之间的扩散。尽管Vc在叔丁醇中的溶解度相对较大些，但考虑到它不利于底物的转化，且沸点高，不利于产物的分离和提纯，所以选用丙酮作为溶剂用于合成Vc酯比较理想。

为增大反应的转化率，通常增加棕榈酸的摩尔比例，在Vc和棕榈酸的摩尔比(1∶ 3)～(1∶ 9)范围内，进行酶催化酯化反应[17-19]，棕榈酸摩尔比例的增加，虽然一定程度上提高了反应的转化率，但却增加了产物提纯的难度，要把过量的棕榈酸从产物中除去，就会降低产物的总收率。所以，最好能在底物比例为1∶ 1时进行有效的酶催化反应，以便于产物的提纯。当底物比例为1∶ 1，且以丙酮为溶剂，24 h后器壁-ANL和脱脂棉-ANL催化反应的转化率分别为51.8%和62.2%(表 1)。脱脂棉-ANL表现出较好的催化能力。如果适当延长催化反应时间，加入吸水剂[20]，增大转化率，产物的提纯只需将溶剂蒸出即可。与ANL在树脂上固定化及催化类似反应体系的研究相比较[21]，器壁-ANL和脱脂棉-ANL不仅催化温度低、摇动速度小、催化时间短、溶剂易除去，而且反应转化率明显高于前者(42.1%)。

表1 ANL催化反应24 h后的转化率

3 结论

为探索Vc棕榈酸酯的低碳合成及纯化工艺，制备了固定化脂肪酶器壁-ANL和脱脂棉-ANL。以固定化ANL为生物催化剂，Vc和棕榈酸为底物，研究了酶促酯化反应的动力学，并研究了溶剂、吸水剂和底物比例对酶促反应的影响。研究发现：器壁-ANL和脱脂棉-ANL的催化能力大约是ANL酶粉的2倍，丙酮比叔丁醇更适合作为溶剂，脱脂棉-催化反应24 h后的转化率达90.4%。在底物摩尔比例为1∶ 1时，固定化酶仍保持较好的催化活性，24 h后，脱脂棉-ANL可以催化转化62.2%的底物。该结果可以作为今后进行放大实验的基础，在底物摩尔比为1∶ 1时，通过加入吸水剂、适当延长反应时间等，使反应达到足够的转化率，然后通过蒸除溶剂得到较纯净的Vc棕榈酸酯。