茶黄素双没食子酸酯的酶法合成条件优化与纯化

吴光亮，刘新涛，胡 冰，孙 怡，曾晓雄*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

茶作为一种消费量高的饮品，在世界范围内广受人们的喜爱。按照茶叶发酵程度的不同，茶叶可分为3 种类型：绿茶（未发酵茶）、乌龙茶（半发酵茶）和红茶（全发酵茶）[1]。红茶在世界茶叶产量和消费量等方面占据主导地位，研究表明红茶具有抗肿瘤[2]、预防心脑血管疾病[3-4]、预防糖尿病[5]、抗肥胖[6-7]、抗病毒[8]、抗炎症[9]和抗氧化[10-11]等生理功能，这些生理功能和红茶中茶黄素类物质密切相关[12-13]。

茶黄素类物质是在红茶生产过程中儿茶素类物质在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）作用下成对氧化形成的一类二聚体[14]，它在红茶中的质量分数为0.5%～2%，是与红茶感官品质和功能性密切相关的主要成分[15-16]。茶黄素类物质主要由4 种茶黄素单体（图1）组成，它们分别为茶黄素（theaflavin，TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-O-gallate，TF2A）、茶黄素-3’-没食子酸酯（theaflavin-3’-O-gallate，TF2B）、茶黄素-3,3’-双没食子酸酯（theaflavin-3,3’-O-digallate，TFDG）[17]，TFDG为红茶中主要的茶黄素。TFDG是表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallatocatechin gallate，EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）的氧化产物[18]，但是它在红茶中含量很低，蔡海兰等[19]分析了9 个产区红茶的茶黄素含量，TFDG平均质量分数为0.32%，最低为0.21%，最高为0.54%，这为深入研究和利用TFDG带来了困难，大规模制备高纯度的单体是现阶段亟待解决的问题。

图1 茶黄素的化学结构Fig.1 Chemical structures of theaf l avins

获取茶黄素粗品的方法主要有直接提取法、化学合成法和酶促合成法。酶促合成法指利用PPO在通氧的条件下催化儿茶素合成茶黄素的方法，酶促合成法效率高、安全性好。不同来源的PPO之间活性差异较大，其中梨PPO合成茶黄素的能力较高[20]，是理想的PPO来源。茶黄素的分离纯化方法主要有柱层析法[21]、制备型高效液相色谱法和制备型高速逆流色谱（high speed countercurrent chromatography，HSCCC）法[22-23]。为大规模制备TFDG单体，本研究利用单因素试验和响应面法中的Box-Behnken设计优化TFDG合成底物EGCG/ECG物质的量比、pH值和温度等反应条件，并利用AB-8层析柱结合HSCCC从酶促反应液中纯化TFDG单体。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皇冠梨（Pyrus bretschneideri Rehd cv. Huangguan）南京市苏果超市；EGCG、ECG 成都普瑞法科技开发有限公司；不溶性聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pynrolidone，P V P P） 北京市索莱宝生物科技有限公司；乙腈、乙酸乙酯（色谱级） 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Agilent公司；5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱 日本Cosmosil公司；BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；EYELA旋转蒸发仪 日本东京理化公司；LyoQuest-55真空冷冻干燥机 西班牙Telstar公司；CJJ78-1磁力加热搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 PPO粗酶液的制备

参考李健等[24]方法并稍作修改。称取100 g去皮后的皇冠梨切成碎块，加入适量PVPP、VC和预冷的柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.6）100 mL，捣碎，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液。往上清液中缓慢均匀加入硫酸铵粉末，制成70%硫酸铵饱和度的溶液，粗酶液制备操作在冰浴中进行，所得溶液4 ℃冰箱中过夜，10 000 r/min离心10 min，沉淀以适量pH 5.6柠檬酸-磷酸盐缓冲液溶解，即为PPO粗酶液。

1.3.2 PPO催化儿茶素合成TFDG的条件优化

按一定的EGCG/ECG物质的量比称取EGCG和ECG，加入到50 mL一定pH值的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，使得ECG终浓度为10 mmol/L，加入1 mL PPO，于一定温度120 r/min磁力搅拌下进行酶促反应，HPLC分析反应液中各个组分含量。TFDG产率计算见下式：

式中：a为TFDG合成的物质的量；b为加入的ECG物质的量。

1.3.2.1 单因素试验

选择EGCG/ECG物质的量比、pH值和温度3 个单因素分别进行单因素试验。固定pH 4.5、反应温度30 ℃，探究EGCG/ECG物质的量比（1∶1、3∶1、4.5∶1、6∶1、9∶1）对TFDG产率的影响。固定EGCG/ECG物质的量比3∶1、反应温度30 ℃，探究pH值（3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）对TFDG产率的影响。固定EGCG/ECG物质的量比3∶1、pH 4.5，探究温度（15、25、35、45、55 ℃）对TFDG产率的影响。

1.3.2.2 响应面试验

利用单因素试验确定的水平范围，应用Design-Expert 8.0.6软件设计3因素3水平的响应面试验并确定PPO催化合成TFDG的最佳试验条件。响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素及水平Table1 Level and code of factors used for Box-Behnken design

1.3.3 HPLC分析

方法1：参考薛金金[25]方法，HPLC分析采用Agilent液相色谱仪，色谱柱：5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测波长：280 nm；流动相：A：50 mmol/L磷酸；B：乙腈；流速：0.7 mL/min；梯度洗脱程序：0～39 min，96%～70% A相；39～54 min，70%～25% A相。

在方法1基础上稍作修改得方法2：H P L C分析采用Agilent液相色谱仪，色谱柱：5C18-AR-II（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；检测波长：280 nm；流动相：A：50 mmol/L磷酸；B：乙腈-乙酸乙酯（7∶1，V/V）；流速：1.0 mL/min；洗脱程序：0～25 min，82%～68% A相。

1.3.4 TFDG单体的纯化

以最优EGCG/ECG物质的量比、pH值及温度条件下酶法合成TFDG，反应60 min后置于沸水浴5 min灭酶以终止酶促反应，随后将反应液上样于AB-8层析柱，先用1 个柱体积（BV）的水洗脱层析柱，除去反应液中的蛋白等杂质，再用2 BV的90%乙醇溶液洗脱层析柱，收集乙醇洗脱液并浓缩冻干，得TFDG粗品。

参照江和源等[26]方法利用HSCCC从TFDG粗品中纯化TFDG单体。配制水-乙酸乙酯-正己烷-甲醇（6∶3∶1∶1，V/V）的两相溶剂体系，将其充分混合后，静置分层，上相作为固定相，下相作为流动相；称取适量的TFDG粗提物，加入15 mL上相溶解并上样于HSCCC仪，转速：800 r/min，流速：2.0 mL/min，检测波长：280 nm，温度：25 ℃，流出液部分收集器收集利用HPLC检测，将TFDG组分合并浓缩冻干，即为TFDG单体。

2 结果与分析

2.1 生成TFDG的HPLC检测结果

图2 黄冠梨PPO合成TFDG的HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of reaction mixtures during TFDG synthesis mediated by PPO from Huangguan pear

如图2所示，梨PPO可以催化EGCG和ECG合成TFDG，经过60 min的反应，大部分EGCG和ECG转化为TFDG，这说明梨PPO具有较好的合成TFDG能力。因此，本研究以TFDG产率高低作为评价标准，探讨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的最适EGCG/ECG物质的量比、pH值和反应温度。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 EGCG/ECG物质的量比对合成TFDG的影响

图3 EGCG/ECG物质的量比对梨PPO合成TFDG的影响Fig.3 Effect of EGCG/ECG molar ratio on the synthesis of TFDG

TFDG的生成过程为EGCG和ECG生成相应的醌和；相应的醌再等量结合生成TFDG。据文献[27]报道，反应体系中EGCG可能会被酶氧化所消耗，使得EGCG产生的醌不足以和ECG产生的醌相结合；且EGCG容易被ECG产生的醌氧化，导致EGCG的量进一步减少，因此需提高反应体系中EGCG/ECG物质的量比。由图3可知，以EGCG和ECG作为底物合成TFDG时，EGCG和ECG的物质的量比对TFDG产率影响较大。EGCG/ECG物质的量比为1∶1时，EGCG产生的醌不足以和ECG产生的醌相结合，TFDG的产率为54.1%；但是EGCG/ECG物质的量比为3∶1时，EGCG产生的醌足以和ECG产生的醌相结合，TFDG的产率可大幅度提高到77.3%，随着底物物质的量比例的升高，TFDG的产率并未明显提高。为节约儿茶素同时保证TFDG产率，设定EGCG/ECG物质的量比为3∶1作为响应面试验的中心点。

2.2.2 反应pH值对合成TFDG的影响

图4 反应pH值对梨PPO合成TFDG的影响Fig.4 Effect of reaction pH on the synthesis of TFDG

TFDG在碱性条件下不稳定，且PPO活性受pH值影响较大，可见反应pH值对于TFDG产率有着重要影响。由图4可知，当pH值为3.0时，酶活力在该pH值条件下比较低，导致TFDG的产率仅为22.7%；pH值在4.0～5.5范围时，TFDG产率为80%～87%；当pH值升高到6.0～7.0时，TFDG产率急剧下降至35.5%，推测pH值升高使得PPO活力下降，且TFDG在碱性条件下不稳定。根据单因素试验结果，选取pH 4.0作为响应面试验的中心点。

2.2.3 反应温度对合成TFDG的影响

图5 反应温度对梨PPO合成TFDG的影响Fig.5 Effect of reaction temperatures on the synthesis of TFDG

温度对酶促反应的影响表现在2 个方面：一方面是温度升高，酶促反应速度加快；另外一方面温度升高，酶的高级结构发生变化导致酶活性降低甚至失去。从图5可以看出，温度升高到35 ℃，TFDG的产率随着温度的升高而增加，在35 ℃左右TFDG产率达到峰值，随后开始下降。由此，选择35 ℃作为响应面试验的中心点。

2.3 响应面试验结果与分析

通过响应面法对EGCG/ECG物质的量比（X1）、pH值（X2）和反应温度（X3）3 个因素的优化设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 多元回归模型方差分析Table3 Analysis of variance for the quadratic polynomial model

通过Design-Expert 8.0.6软件对表2的数据进行分析，得到方差分析结果如表3所示。由表3可知，p H值和温度对T F D G得率的影响极显著（P＜0.01）。以TFDG得率作为响应值，经过拟合后得回归方程：TFGD产率=84.26+0.44X1+2.20X2+1.39X3-0.25X1X2+0.78X1X3-1.55X2X3-3.19X12-4.82X22-2.89X32。

回归模型的F值较高（6 7.4 6），P值较低（＜0.000 1），说明模型极显著。该模型的决定系数R2值为0.986 4，表明TFDG产率的实验值和预测值间的一致性良好；调整系数值为0.968 9，说明TFDG产率总变异中的96.89%由独立变量决定，所研究的因素中只有3.11%不能被此回归模型解释。此外还可得出独立变量对TFDG产率的影响次序为pH值＞反应温度＞EGCG/ECG物质的量比。

由图6可以直观地看出，各因素交互作用对TFDG产率的影响，若曲线越陡峭，表明各因素对得率的影响越大[28]；2D图形状可以说明因素间的交互作用显著与否，若等高线是圆形，说明交互作用不显著，若为椭圆，则显著[29]。pH值和反应温度对TFDG产率的影响作用较大，两者交互作用显著，这与表3结果吻合。

图6 多元回归模型响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots for the quadratic polynomial model

通过软件分析确定PPO催化合成TFDG的最佳条件为EGCG/ECG物质的量比为3.08∶1、pH 4.10、温度36.96℃，在此条件下计算得出的TFDG产率理论值为84.63%。为方便实验进行选取EGCG/ECG物质的量比3.1∶1、pH 4.10、温度37 ℃进行验证实验，得到TFDG产率为（85.14±0.40）%，实验值与预测值一致性较好。说明该多元二次回归方程可靠性较好，适合对TFDG产率的预测。

2.4 TFDG单体的纯化结果

大孔吸附树脂多用于黄酮类、生物碱类和苷类等成分的分离纯化，具有吸附量大、选择性好、再生简单和成本低等优点。郁军等[30]研究了NKA-9、AB-8和ADS-73 种不同极性的大孔吸附纯化茶黄素的工艺条件，结果发现ADS-7的纯化效果最差，NKA-9较AB-8有更高的解吸率，但是两者差别不大。本实验使用AB-8树脂对酶法合成的TFDG进行纯化，以除去反应液中的蛋白等杂质。同时，HSCCC是无载体的分离，所以不存在载体的吸附，样品利用率高，HSCCC最大的优点在于进样量大，因而在生物医药、天然产物及食品领域被广泛利用。本研究先用AB-8树脂对酶促反应反应液进行纯化得到TFDG粗品，再利用HSCCC纯化粗中的TFDG单体。

图7 HSCCC纯化TFDG粗提物色谱图（A）、TFDG单体的HPLC图（B）Fig.7 HSCCC chromatogram of crude TFDG (A) and HPLC of monomeric TFDG (B)

图7A为HSCCC纯化TFDG的色谱图，经HPLC分析2号和3号峰分别为EGCG和ECG，4号峰为TFDG（图7B），TFDG的纯度可达到97%，说明该方法能够高效地从TFDG的粗提物中纯化出高纯度的TFDG单体。

3 结 论

通过单因素试验探讨了物质的量比（EGCG/ECG）、pH值和反应温度对皇冠梨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG的影响，利用Box-Behnken试验优化得出最佳底物物质的量比（EGCG/ECG）3.1∶1、pH 4.1、反应温度37 ℃；利用AB-8层析柱结合HSCCC对最优反应条件下合成的TFDG反应液进行纯化，TFDG产率和纯度分别能达到85.14%和97%；实验表明该方法对TF1、TF2A和TF2B的制备同样适用，因此本研究为高效率制备各茶黄素单体提供了参考依据。