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第26届国际生物学奥林匹克竞赛试题实验2·分子生物学

2018-07-23王戎疆佟向军范六民刘宝玉

生物学通报 2018年9期
关键词:考务凝胶电泳琼脂糖

王戎疆 张 立 佟向军范六民 刘宝玉

(1北京大学生命科学学院 北京 100871 2北京师范大学生命科学学院 北京 100875 3天津市第一中学 天津 300051)

总分:100分

考试时间:90 min

共15题

本考题由3部分组成。

第1部分:质粒的限制酶图(48分);

第2部分:基于PCR的酵母突变体基因分型(37分);

第3部分:突变酵母的氨基酸营养缺陷(15分)。

任务1:

1)检查材料和设备。

2)选择限制酶。

3)孵育酶切反应。

4)配制琼脂糖凝胶。

5)准备样品并加载凝胶。

6)凝胶电泳*。

任务2:

7)拍摄凝胶照片及回答问题。

8)设置PCR反应。

9)PCR反应。

10)准备样品并加载凝胶。

11)凝胶电泳*。

任务3:

12)拍摄凝胶照片及回答问题。

13)观察和推论。

*注意:在操作时使用同一块凝胶上不同的样品孔。

材料和设备

现代生物技术作为21世纪的主要技术之一,它产生于食品研究,同时又很快被应用于食品生产。对于解决国家粮食危机,转基因产品举足轻重。但随着转基因产品对人们日常生活的影响不断扩大,其安全性遭到质疑。如何应对转基因产品,成了政府迫切需要解决的问题。目前,全球各国都在寻求一条有效途径,来平衡两者的冲突。如何用法律制度对其进行规制,已成为人类目前面临的重要问题之一。

为了完成实验工作,你需要下面列出的材料。请确保可以获取这些材料。每位考生只有一份实验材料,在考试过程中请谨慎操作。

请注意:1)为了完成分析,实验中提供的所有液体试剂都超过了所需用量的2倍。在实验过程中出现溢出或错误时,不提供附加材料(包括实验器材和琼脂糖凝胶)。2)为了在管底收集液体,请使用手册中注明的技术。3)考试的目的之一是测试你的实验工作技能。4)标签上标有蓝线的试管应一直保存在冰上。5)所有溶液都处于冷冻状态,所以你必须在使用前对其进行解冻和混匀。

材料编号 数量 材料 在本试卷中需要使用的部分A 1 微量移液管 1~10 μL 1,2 B 1 微量移液管 20~200 μL 1,2 C 1 盒移液枪白枪头 1~10 μL 1,2 D 1 盒移液枪黄枪头 20~200 μL 1,2 E 1 PCR管架 1,2 F 1 1.5 mL 管架 1,2 G 5 1.5 mL管(有管盖)2 H 2 0.2 mL PCR管(有管盖,不要将管和盖分开)1,2 I 1 12孔琼脂糖凝胶(请勿打开包装,直到你准备加载凝胶)1,2 J 1 OneRun电泳系统;缓冲液 1,2 K 1 记号笔 1,2 L 1 秒表/定时器 1,2 M 1 纸巾 1,2 N 1 一套塑料手套(在候考时发放)1,2 O 2 拉锁袋(信封)1,2 P 1 含有8种不同培养基上生长的酵母照片的手册 3 Q 1 用于生成各种氨基酸的生化反应图(在工作区的墙上)3 R 1 1 Kb Plus DNA marker 1,2 S 1 联系考务人员时所需的粉红卡片 1,2,3 T 2 小型标签 1,2 U 1 大标签 1 V 1 540 μL 水 1,2

材料H:具有国家代码和学生编号的ID标签和试管

冰桶含有1.5 mL管和一套液体。

液体编号 数量 标签 体积(μL)成分1 1 dNTP 60 dATP、dGTP、dcTP和dTTP 混合物2 1 DNApol缓冲液 140 DNA聚合酶缓冲液(5×)3 1 上样缓冲液 100 加载缓冲液,用于琼脂糖凝胶电泳4 1 引物A 30 引物对A 5 1 引物B 30 引物对B 6 1 引物C 30 引物对C 7 1 引物D 30 引物对D 8 1 引物E 30 引物对E 9 1 DNApol 14 脱氧核糖核酸聚合酶10 1 1 Kb marker 12 DNA marker,用于琼脂糖凝胶电泳11 1 缓冲液1 8 缓冲液1(10×)12 1 缓冲液2 8 缓冲液2(10×)13 1 缓冲液3 8 缓冲液3(10×)14 1 模板WT 6 野生型模板DNA 15 1 突变体模板 6 突变体模板DNA 16 1 质粒1 6 质粒1 17 1 质粒2 6 质粒2 18 1 ApaI 6 ApaI限制酶19 1 EcoRI 6 EcoRI限制酶20 1 SmaI 6 SmaI限制酶

1 限制酶选择(48分)

设计一个实验以确定酿酒酵母中蛋白质Alb的亚细胞定位。实验策略要求将基因alb(999bp)与编码2种不同荧光蛋白的序列融合。这是通过将基因克隆到2个质粒骨架(pX和pZ)中实现的,最终可得到质粒pX:alb和pZ:alb。用2个连接混合物转化大肠杆菌。纯化来自2个大肠杆菌转化体的质粒,得到“质粒管1”和“质粒管2”中的DNA。请确定2个管中包含有4个可能质粒(pX,pX:alb,pZ或pZ:alb)中的哪2个(每个管中1个)。

问题1.DNA片段大小。(2分)

用标签表示4种质粒完全酶切获得的DNA片段的预期大小。

限制酶及其最佳反应条件表

对2个质粒进行严格的限制性内切酶设计。

问题2.选择限制性内切酶。(4分)

你有3种限制酶可用:ApaI、EcoRI和SmaI。点击这3种酶中的一种,可以区分4种可能的质粒。请注意,长度小于100 bp的DNA片段将产生非常微弱的条带,并且不能准确地确定它们的大小。

A.ApaI B.EcoRI C.SmaI

问题3.设计研究方案。(4分)

步骤:

1)分别用S1、S2、S3和S4标记0.2 mL PCR管。

2)设计酶切实验,以确保使用所有2种质粒,其中包含未切割质粒DNA的对照。每个反应的总体积应为10 μL。典型的限制酶酶切包括:2 μL质粒DNA,1 μL限制酶,1 μL缓冲液和加水至终体积为10 μL。

用整数表示添加到4个管中的每一种液体体积(所有量都以μL计)。如果不添加此特定成分,请写入“0”。

S1(μL)S2(μL)(对照)S3(μL)S4(μL)(对照)质粒管1质粒管2 ApaI EcoRI SmaI 10 x缓冲液1 10 x缓冲液2 10 x缓冲液3水总容积

问题4.酶切的反应条件。(2分)

继续步骤:

3)按照问题2中的说明,混合限制性酶切反应的必要组分。

4)将移液器的体积设置为5 μL,并通过在每个管中上下吸打5~10次进行充分混合。始终保持移液管尖端在液体表面以下,避免产生气泡。

5)将0.2 mL管放在小的拉链锁袋中。关闭袋子,并将标签上的ID号贴在包装袋外面。

请指出你用于酶切的反应条件:

A.25℃ B.37℃

继续步骤:

6)举起你的粉红色卡片与考务人员联系,考务人员会将你的样品送到所选的培养箱。完全酶切质粒DNA需要15 min的孵育。

7)20 min后,你的粉红色卡片会提示你收回样品。

8)请检查你是否收到了自己的样品。

9)向每个样品中加入3 μL加样缓冲液。

10)通过上下吸打10次混合(避免产生气泡)。

使用标准琼脂糖凝胶电泳方法,通过凝胶电泳分析限制酶酶切的效果。

警告:电气危险-RunOne电泳仪一旦启动就不要移动。开始时,请勿将物品穿过设备盖子的薄片加入。

警告:潜在的危险化学物质。当处理琼脂糖凝胶时,始终佩戴手套,因为它是与DNA结合染料一起预染的。

建议的操作流程:通过琼脂糖凝胶电泳分析第1部分和/或第2部分的样品。a.加载第1部分的样品并运行15~20 min。b.停止设备。c.加载第2部分样品。d.重新启动设备,再运行15~20 min。

电泳方案:1)戴橡胶手套。2)将RunOne电泳室的盖子抬起直立。3)从白色袋子包取出琼脂糖凝胶准备进行电泳。拆下透明盖子,并将凝胶从透明外壳小心地提起。小心处理凝胶,因为它容易断裂。保留白色袋子供以后使用。4)检查凝胶是否存在明显的损坏,如裂缝/缺少孔或凝胶内部有气泡等。如果你发现此类问题,请立即通过举起粉红色卡片向考务人员报告。5)如下图所示放置凝胶。

继续操作步骤:

7)凝胶应完全浸没在缓冲液中。如果不能,请考务人员提供适当的帮助。

8)如下2个表(第1部分的样品、第2部分的样品)所述装载琼脂糖凝胶。加载3 μL 1 Kb marker、13 μL样品(第1部分)和15 μL(第2部分)。

第1部分(1~5孔)

第2部分(6~12孔)

继续电泳步骤:

9)将盖子放在RunOne装置上(有标签的一面向下滑入电源盒)。

10)检查电压是否设置为100 V,否则使用“电压选择”按钮。

11)按“运行/停止”按钮打开电源,运行凝胶电泳15~20 min。请注意,你将无法看到通过凝胶实时迁移的DNA带,但缓冲液中的蓝色指示剂与300 bp DNA片段的迁移速度相同。

12)20 min后,按“运行/停止”按钮关闭电源。

13)举起你的卡片,考务人员将带给你在琼脂糖凝胶上查看DNA所需的设备,并记录下来。

14)通过使用你的平板电脑和考务人员为你带来的设备,将凝胶中的DNA带记录下来。考务人员将协助你进行记录。

15)将托盘中的琼脂糖凝胶转移到灯台上。

16)将黑色照片罩放在灯台的顶部。

17)将平板电脑放在照相机的顶部,使透镜向下指向室内。

18)拍摄你的凝胶图片。

问题5.拍照记录你的DNA电泳结果。

拍摄DNA凝胶的3张照片。这些图像将用于判断你的PCR和限制酶酶切反应是否成功。

上传你的3张凝胶图像。

完成拍照,请将凝胶转移到交付的白色袋子里。

问题6.使用限制酶酶切质粒DNA。

在下图中指出质粒DNA是否已被添加的限制酶酶切。

现在请根据提供的标准凝胶图片,对照你选择的限制酶获得的结果(问题3)。使用这张照片回答问题7和8。请注意,你只有在完成凝胶记录后才可以使用标准图片。

问题7.限制酶酶切的DNA片段大小。

如果在限制酶酶切中存在给定大小的DNA片段,则用标签表示出来。

问题8.每管中质粒的鉴定。

指示出每个管中存在哪些质粒,不存在哪些质粒。如果不能确定管中的质粒存在与否,则在最后一列中用“+”表示。

2 基于PCR的基因组遗传检测(37分)

前期工作中已经分离出突变体酵母菌株。这种酵母菌株在生长培养基中需要酪氨酸和苯丙氨酸才能繁殖。突变体在没有色氨酸的培养基上生长的能力尚未测试。突变菌株的回交显示仅单个基因受到了影响。你的任务是确定观察到的营养缺陷的遗传基础。你可以使用5个引物对(下表),每个引物对能检测编码芳香族氨基酸生物合成途径中5种关键酶的基因的功能障碍(突变体)等位基因(下图)。

可用的引物对及它们扩增的基因预期的DNA片段大小

用于形成芳香族氨基酸的生物合成途径(左上:色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸,假苯甲酸酯,分支酸盐和莽草酸酯)及编码途径中各个酶的基因

问题9.选择引物对。(5分)

通过结合5个引物对中2对可用引物(上表)的结果,可以确定在突变酵母菌株中观察到的营养需求的遗传基础。

在下图中指出选用的2个引物对(上表中A,B,C,D或E的组合)

步骤:

1)在1.5 mL管中制备PCR反应的混合物:196 μL水+70 μL DNA聚合酶缓冲液(5×)+35 μL dNTP+7 μL DNA聚合酶。

2)将移液管设置为100 μL,上下吹打5~10次。

3)找到0.2 mL PCR管标签条,并粘贴在一个带有ID号的小标签上。

4)标记管1~6(不要将管条分离,否则你的样品将不能参加PCR反应)。

5)将44 μL混合物平均转移至6个PCR管中的每一个中。

6)对于管1~3,加入5 μL你选择的第1个引物对。

7)对于管4~6,加入5 μL你选择的第2个引物对。

8)向管1和4加入1 μL野生型模板DNA。

9)对于管2和5,加入1 μL突变体模板DNA。

10)对于管3和6,加入1 μL水。

11)在PCR程序中将移液管设定为45 μL,上下移动5~10次混合各个反应。关闭盖子。

3个PCR程序(1~3)(结束后存储在10°C)

问题10.选择PCR程序。(2分)

请指出,如果引物溶解温度(Tm)为60℃,DNA聚合酶可以以72 bp/s的速度在72℃下合成DNA,则3种PCR程序中哪一种(上表)能够成功应用于扩增?

A.PCR程序1 B.PCR程序2 C.PCR程序3

重要提示:

1)请确保你按照步骤回答问题9和10。一旦你对答案表示确定,请点击“LOCK ANSWERS”锁定。注意:锁定后,将无法再更改答案。

2)一旦你的答案被锁定,请举起卡片,考务人员将把你的样品转移到PCR仪。PCR程序需要20 min左右才能完成(此时可转到第1部分或第3部分)。

3)20 min后,你的卡片将会提示送回你的样品。

4)收到样品后,请检查它们是否为你的样品。

5)准备将PCR样品进行琼脂糖凝胶电泳,每个样品中加入10 μL加样缓冲液,并通过上下吹打5次混合均匀(避免产生气泡)。

6)按照琼脂糖凝胶电泳部分所述方法装载样品。

7)通过拍摄照片记录凝胶(该凝胶的照片将被评估,最多可以获得22分)。你现在将获得一个标准的凝胶图片,基于你以前选择使用的引物对PCR分析。请使用这些信息回答问题11和12。注意:你只有在得到考务人员发回你的凝胶照片后,才能获得标准的凝胶图片。

问题11.DNA片段大小。(4分)

如果给定大小的所得DNA(bp)产物存在,则请在此处注明“+”,并逐列报告结果。

问题12.功能异常酶的分析。(4分)

根据你的结果,指出每种酶功能状态。

3 突变酵母的氨基酸营养体分析(15分)

多年来,单倍体真菌酿酒酵母(面包酵母)已被用作模拟生物体,用于阐明真核生物中的新陈代谢过程。酵母通常能够合成蛋白质所需的全部20种氨基酸。在经过UV-诱变后,研究人员已经分离出各种氨基酸营养缺陷突变体。下面具有8张照片的手册描绘了在8种不同培养基(A~H)上生长的单倍体酿酒酵母菌株1~5。位置1=无接种物,位置2=菌株1;位置3=菌株2;位置4=菌株3;位置5=菌株4;位置6=菌株5。板A~H的培养基组成在下表中给出。请注意:不要在照片上留下任何注释。

培养基成分

问题13.菌株生长情况分析。(10分)

记录各种菌株的生长或缺乏生长,用“+”表示生长,“-”表示不生长。

问题14.功能缺陷的酶的分析。(5分)

基于记录的生长模式,推导出在5个菌株(1~5)中哪个或哪些最有可能存在功能缺陷的酶(如果有的话)。对于每个突变体,写入功能缺陷酶所在步骤的数字(1~31)(见培养基成分表),如果没有步骤功能失调,则填0。

考试结束。

(待续)

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