横根费菜不同溶剂萃取部位止痒抗炎作用研究

韩宁娟，方欢乐，牛 睿，刘倩妮，于晋茹，刘利兵

(西安培华学院医学院，西安 710125)

皮肤瘙痒是皮炎、湿疹和荨麻疹等皮肤疾病常见的临床表现，瘙痒发生的机制尚不明确，可能由多种化学物质引起，如组胺和前列腺素等[1]。横根费菜(SedumkamtschaticumFish)又名金不换、北景天等，为景天科景天属多年生草本植物，具有活血、止血、消肿和解毒的功效，主治蚊虫叮咬、痈肿和跌打损伤等，有很好的食用、药用价值。现代研究表明，横根费菜的主要成分是酚酸类、黄酮类和生物碱等[2-3]。民间用其新鲜汁液治疗蚊虫叮咬后引起的瘙痒，效果显著[4]。文献报道，景天科景天属植物的黄酮类成分具有抗炎、止痒作用[5-6]。本研究采用右旋糖酐致小鼠瘙痒模型和二甲苯致小鼠耳肿胀模型，从止痒、抗炎两方面观察横根费菜不同极性溶剂萃取部位的药效，将横根费菜开发为天然止痒抗炎产品，为其临床应用提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 UV-2102紫外-可见分光光度计，FA1004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；游标卡尺(0～150 mm，杭州杭工量具制造有限公司)。

1.2试药 横根费菜(采自陕西省咸阳市，经西安交通大学生药学徐文友教授鉴定)；右旋糖酐40葡萄糖注射液(新疆制药厂，批准文号：国药准字H20033280)；复方醋酸曲安奈德溶液(广东恒诚制药有限公司，批准文号：国药准字H10930202)；肤得安凝胶(沈阳康氏医药保健品有限公司，批准文号:辽卫消证字2002第0043号)；生理盐水(哈尔滨三联医药有限公司，批准文号：国药准字S10870001)；其他试剂均为分析纯。

1.3动物 昆明种小鼠由空军军医大学动物中心提供，合格证号：SCCK(军)2012-0007。

2 方法

2.1横根费菜不同极性溶剂萃取部位的制备 取横根费菜适量，粉碎，按照料液比1∶5加入体积分数为75%的乙醇，回流1 h，过滤，将滤渣再用体积分数为75%的乙醇回流提取2次，过滤，将2次滤液合并，减压浓缩成浸膏，真空干燥，可得横根费菜乙醇提取物。称取一定质量的乙醇提取物，用适量蒸馏水溶解，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各萃取3次，将所得萃取液合并后减压浓缩成浸膏，真空干燥，可得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水部位，密闭盛放在消毒处理的玻璃瓶内，4 ℃保存[7-8]。临用前，用生理盐水将横根费菜乙醇提取物及不同极性溶剂萃取部位溶解，制得横根费菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位(药液1 mL均相当于生药1 g)。

2.2不同极性溶剂萃取部位总黄酮含量的测定 参考文献方法[9-10]，准确称取芦丁对照品5.00 mg，用体积分数为75%的乙醇溶解，移至25 mL量瓶中定容，即得质量浓度为0.2 mg·mL-1的对照品溶液。分别量取对照品溶液0，0.2，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6，1.8和2.0 mL，置于5 mL量瓶中，加0.15 mL质量浓度为0.11 g·mL-1的亚硝酸钠水溶液，摇匀，放置6 min；加0.15 mL质量浓度为0.03 g·mL-1的硝酸铝，摇匀，放置6 min；加2.00 mL质量浓度为0.8×106g·mL-1的氢氧化钠，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min。于波长510 nm处测定吸光度值。用无水乙醇做空白实验。绘制标准曲线，得回归方程为：y=12.325x+0.004 25，r=0.999 5。

横根费菜乙醇提取液和不同极性溶剂萃取部位总黄酮含量的测定：吸取各组分溶液1 mL，按照绘制标准曲线的方法测定吸光度值A，结果以横根费菜中含有相当于芦丁的质量表示，单位为mg·g-1。

横根费菜中总黄酮的含量(mg·g-1)=(y×V)/(V0×m)

y为标准曲线计算出的质量浓度(mg·mL-1)；V为提取液的总体积(mL)；V0为加样体积(mL)；m为横根费菜质量(g)。

2.3横根费菜对右旋糖酐诱发小鼠皮肤瘙痒模型的影响 依据文献记录方法制备小鼠皮肤瘙痒模型，取小鼠70只，随机均分为7组，设模型组(生理盐水)、阳性对照组(肤得安)、横根费菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位。各组小鼠右后足背部剃毛2 cm×2 cm，分别将给药组或模型组按照0.1 mL·cm-2均匀涂于剃毛区，涂抹肤得安药膏厚度为2 mm (相当于0.3 g·cm-2)，于末次给药30 min后，小鼠尾静脉注射质量浓度为12.8 mg·L-1的右旋糖酐0.01 mg。瘙痒指标为小鼠开始搔抓头部和躯干，嘴咬全身。记录30 min内小鼠搔痒次数和搔痒持续时间。

2.4横根费菜对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀模型的影响 依据文献记录方法[11-12]制备小鼠耳廓肿胀模型，小鼠70只，分组同2.2项下。各组小鼠分别在实验当日按照0.1 mL·cm-2右侧耳廓涂药1次，模型组涂以等容量的生理盐水溶液，阳性对照组涂抹曲安奈德药膏厚度为2 mm (相当于0.3 mg·cm-2)。1 h后各组用蒸馏水洗去药液，棉球擦净；给小鼠右耳涂二甲苯20 μL·只-1，左耳作对照。15 min后断颈处死动物，沿耳廓基线剪下双耳，在左右耳相同位置用6 mm角膜环钻冲下耳片，精密称定质量，计算肿胀度并求出肿胀抑制率。

肿胀度(mg)=右耳耳片质量(mg)-左耳耳片质量 (mg)

肿胀抑制率=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)÷模型组平均肿胀度×100%

2.5检测不同样品炎症因子的比较 采取经过建立模型各组小鼠的血液2 mL，进行生化检验，主要检测肿瘤坏死因子(TNF-β)、白介素-6(IL-6)和一氧化碳(NO)，各指标检测均严格按照实验或相应试剂盒要求步骤进行。

3 结果与分析

3.1横根费菜不同极性萃取部位中总黄酮含量的测定 测定横根费菜提取物和不同极性萃取部位中总黄酮的含量，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位分别为7.65%，1.25%，13.50%，3.75%和0.75%，乙酸乙酯层中总黄酮含量最高。

3.2横根费菜不同萃取部位对小鼠皮肤瘙痒的影响 与模型组比较，横根费菜乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能显著减少右旋糖酐致小鼠瘙痒次数、缩短瘙痒持续时间、具有止痒作用。横根费菜乙酸乙酯部位止痒作用最优。见表1。

表1横根费菜不同极性部位对小鼠皮肤瘙痒的影响

样品剂量/g·cm-2瘙痒次数/次瘙痒持续时间/s模型组-52.40±9.70344.81±90.24阳性对照组0.328.96±8.25** 205.61±66.95**横根费菜乙醇提取物0.126.48±9.62**204.51±74.18**石油醚部位0.150.78±10.25301.24±72.18乙酸乙酯部位0.118.38±7.65** 139.24±65.38**正丁醇部位0.139.06±9.12*253.25±84.76*水部位0.149.40±10.70343.25±103.48

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

3.3横根费菜不同萃取部位对小鼠耳廓肿胀的影响 见表2。由表2可知，与模型组比较，横根费菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对二甲苯引起的耳廊肿胀均具有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯萃取部位作用最优。

3.4横根费菜不同极性萃取部位对炎症因子的影响 各组TNF-β、IL-6和NO等炎症因子水平均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)，其中模型组TNF-β、IL-6和NO表达水平最高，见表3。

表2横根费菜不同极性部位对小鼠耳廓肿胀的影响

组别剂量/g·cm-2肿胀度/mg肿胀抑制率/%模型组-1.92±0.31-阳性对照组0.0031.22±0.15**36.44横根费菜乙醇提取物0.11.41±0.34**26.65石油醚部位0.11.89±0.212.47乙酸乙酯部位0.11.24±0.47**34.42正丁醇部位0.11.68±0.31*15.71水部位0.11.90±0.421.23

注：与模型组比较*P<0.05，**P<0.01。

表3横根费菜不同极性溶剂萃取部位对炎症因子的影响

注：与对照组比较*P<0.05。

4 讨论

本实验通过用乙醇提取横根费菜后，采用石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位进行萃取，观察萃取物对右旋糖酐引起皮肤瘙痒的抑制作用和对二甲苯诱发的小鼠耳廊肿胀的抑制作用，测定各组分的总黄酮含量[13]。结果表明，横根费菜乙醇提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位中黄酮的含量高低与止痒、抗炎效果平行，乙酸乙酯部位中总黄酮含量最高，止痒抗炎效果最好。水部位中总黄酮含量最低，几乎无抗炎作用。此外，本文通过对相关的炎症监测显示各组TNF-β、IL-6和NO等炎症因子水平均高于对照组，其中模型组TNF-β、IL-6和NO表达水平最高，说明经过药物干预后炎症因子均降低，具有一定的效果，其中水部位的效果更明显，目前炎症介质刺激法和化学物质刺激法是瘙痒模型较为常用的建立方法。右旋糖酐致小鼠瘙痒模型症状与临床接近，不会引起其他继发反应，通过瘙痒次数可直观反映小鼠的瘙痒情况[14-15]。二甲苯作为急性炎症动物模型常用的致炎剂，其致炎机制与临床常见急性炎症相似。二甲苯致小鼠耳廊肿胀模型见效快、复制成功率高，因此，本实验选取右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒模型和二甲苯致小鼠耳肿模型用于研究横根费菜的止痒、抗炎作用。

相关文献资料[16]显示，横根费菜为多年生草本，根状茎木质，横生有分枝，叶上、下表皮细胞垂周壁呈波状弯曲，边缘微成波状 ,细胞壁角质化增厚；均有气孔，叶上表皮气孔不等式较多，叶下表皮气孔类型多为不等式[17]、环式，目前临床对于该植物的药物研究以及药物分离较少见，下一步可将乙酸乙酯部位作为研究重点，采用色谱方法对其进行分离纯化，跟踪各分离组分的止痒、抗炎作用，提取分离出横根费菜中止痒、抗炎活性成分并鉴定其结构，探明横根费菜的止痒抗炎作用机制[18-19]。总之，横根费菜乙酸乙酯部位止痒、抗炎的作用最优，且总黄酮含量最高，这说明横根费菜的止痒抗炎作用与总黄酮的含量有关。