关节镜清理联合自体骨髓间充质干细胞移植治疗膝骨关节炎疗效观察

张钟元 江和训 赵锦伟 焦明航

【摘 要】目的：观察关节镜清理联合自体骨髓间充质干细胞移植修复膝骨关节炎关节软骨缺损临床疗效。方法：选取2010年8月至2014年8月行自体骨髓间充质干细胞移植治疗的膝骨关节炎患者53例（61膝），男36例（41膝），女17例（20膝）；年龄39～69岁，平均（57.70±1.68）岁；退行性关节炎49例（57膝），创伤性关节炎4例（4膝）；Kellgren-Lawrence（K-L）分级Ⅰ级35例，Ⅱ级18例。随访2～3年，平均2.4年。治疗前及治疗后3个月、1年、2年根据西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）、视觉模拟评分法（VAS）和软骨损伤评分系统（CaLs）对患者的临床表现、MRI上骨异常信号和软骨损伤面积进行比较，对膝关节功能及磁共振结果进行评定。结果：随访期间，3例（5膝）患者行人工全膝关节置换术，终止随访，50例（56膝）获得随访。①治疗后3个月、1年，膝关节功能较治疗前有明显好转，疼痛减轻，治疗后WOMAC评分及VAS评分呈下降趋势（P < 0.05）；治疗后2年，上述指标与治疗前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。②治疗后磁共振显示：治疗后3个月可见新生类软骨生长，受损关节软骨及软骨下骨有明显修复，软骨损伤评分系统（CaLs）评分降低，与治疗前比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；治疗后1年及2年后软骨修复不明显，CaLs评分较治疗前差异无统计学意义（P > 0.05）。结论：关节镜清理联合自体骨髓间充质细胞移植能有效促进早期膝骨关节炎关节软骨的修复，延缓膝骨关节炎病程的进展。

【关键词】 骨关节炎，膝；自体骨髓间充质干细胞；移植；软骨修复

膝骨关节炎（knee osteoarthfitis，KOA）是一种多因素导致的慢性骨关节疾患，以膝关节疼痛、肿胀和活动受限为主要症状，是中老年人常见的关节疾病。迄今为止，尚没有一种能够有效治愈KOA的方法。自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，其在体外不同条件诱导下可分化为不同组织的能力，为修复受损软骨提供了可能性。笔者采用自体BMSCs移植治疗KOA关节软骨缺损53例（61膝），现将结果报道如下。

1 臨床资料

1.1 一般资料 选取2010年8月至2014年8月在山东省文登整骨医院行自体BMSCs移植治疗的KOA患者53例（61膝），男36例（41膝），女17例（20膝）；年龄39～69岁，平均（57.70±1.68）岁；退行性关节炎49例（57膝），创伤性关节炎4例（4膝）。Kellgren-Lawrence（K-L）分级I级35例，Ⅱ级18例。本研究经山东省文登整骨医院伦理委员会批准。

1.2 诊断标准 按照美国风湿病学会（ACR）修订的《膝关节骨关节炎分类标准》中KOA诊断标准[1]。

1.3 纳入标准 ①符合上述诊断标准；②符合

X线K-L分级评价标准[2]Ⅰ～Ⅱ级；③患者身体状况良好，无手术禁忌，能够遵医嘱完成本治疗且接受随访；④患者签署知情同意书。

1.4 排除标准 ①合并有肝、肾、心脑血管，以及造血系统严重疾病及精神病，不能耐受手术者；②手术部位有严重皮肤疾病者；③对多种药物过敏或过敏体质者；④治疗过程中因各种因素未完成治疗及随访者。

2 方 法

2.1 治疗方法

2.1.1 关节镜清理术前准备 所有患者常规完善血常规、血生化类和凝血功能等排除感染、凝血障碍等情况评估手术可行性，完善膝关节站立位X线片及膝关节MRI，评估患膝软骨及软骨下骨的情况，完成软骨损伤评分系统（CaLs）评分[3]。术前进行膝关节西安大略和麦克马斯特大学骨关节炎指数（WOMAC）评分和视觉模拟评分法（VAS）评分，以了解患膝的功能状况。

2.1.2 关节镜清理 所有患者在硬膜外麻醉下行常规膝关节清理手术，对受损膝关节进行全面探查，评价关节软骨磨损情况，刨削修整受损软骨面，清理炎性滑膜组织，冲洗关节腔，然后使用微骨折椎磨损剥脱的软骨面进行垂直钻孔至创面有新鲜渗血[4-7]。

2.1.3 血小板裂解液、BMSCs的制备及培养 行关节镜手术前，抽取自体静脉血300 mL用于制备血小板裂解液。离心机以1048 r·min-1离心20 min

（离心半径9 cm），吸取上层血清液，-20 ℃冰箱过夜后保存于-80 ℃冰箱中。从-80 ℃冰箱中取出置于37 ℃水浴锅中融化5 min，将融化后的血清置于离心机以3054 r·min-1离心6 min（离心半径9 cm），所获得的上清液即为血小板裂解液。在血小板裂解液中加入质量分数为2.86 mg·mL-1的氯化钙和质量分数为28.56 IU·mL-1的凝血酶，混匀，37 ℃培养6 d后，将样本置于离心机以3054 r·min-1离心6 min（离心半径9 cm）激活，将激活的血小板裂解液在-80 ℃冰箱保存备用。

行关节镜手术同时，消毒患者髂后上棘处，用30 000 IU低分子量肝素钠预处理的注射器穿刺抽取骨髓血60 mL，用于制备、培养BMSCs。利用密度梯度离心法将有核细胞从骨髓血中分离出来，在培养液（DMEM + 质量分数为10%血小板裂解液 + 8 μg·mL-1强力霉素 + 6 μg·mL-1低分子量肝素钠）中培养，2～3 d换液1次。第8天用质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化后进行传代培养、纯化，取第2代细胞分装超低温冷冻储藏备用。

2.1.4 BMSCs移植 BMSCs移植术于关节镜术后1个月进行。术前3 d复苏冻存的第2代BMSCs，培养后于移植当天用质量分数为0.25%胰蛋白酶收集BMSCs，离心机以2340 r·min-1离心6 min（离心半径9 cm），弃上清后以3 mL激活的血小板裂解液重悬。患者仰卧位，膝关节常规关节腔穿刺，抽取关节积液，拔下注射器针管，留置针头接入装有细胞生长因子或混合均匀的BMSCs悬液的无菌针管，缓慢注入关节腔。施术第1天植入血小板裂解液3 mL，第4天植入BMSCs悬液3 mL，第7天植入细胞生长因子3 mL。拔出穿刺针头，无菌纱布按压针眼处5 min，患者俯卧30 min，每5 min屈伸活动膝关节10次。上述注射3次为1个疗程，间隔1个月1次，共治疗3个疗程。

2.1.5 术后处理 术后注意穿刺点的护理，治疗过程中，不负重情况下行膝关节屈伸功能锻炼及患肢肌肉舒缩功能锻炼，避免剧烈活动。定期复查血常规及肝肾功能，评估患者移植后的反应。若出现不良反应，立即停止治疗并评估继续治疗的可行性。

2.2 评价指标 CaLs评分：深度低于50%的浅表缺损评分为1分（A），超过50%为2分（B），全层的软骨缺损为3分（C），深度最大的缺损部分不超过整个缺损直径的50%评分为0.5分（D），超过50%评分为1分（E）。

WOMAC评分即通过患者回答48 h内的关节情况，包括疼痛、僵直、进行日常活动的难度等。没有困难为0分，轻微困难1分，中等困难2分，非常困难3分，极端困难4分。总分最小分值0，最大分值96。VAS可作为评分尺评价患者主观疼痛，0为没有疼痛，10为极端疼痛。

2.3 统计学方法 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用配对t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

随访期间3例（5膝）患者行人工全膝关节置换术，终止随访；50例（56膝）获得随访，随访时间2～3年，平均2.4年。治疗后3个月、1年，WOMAC评分、VAS评分较治疗前均有明显改善（P < 0.05）；治疗后2年，WOMAC评分、VAS评分与治疗前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。治疗后3个月，磁共振显示可见新生类软骨生长，受损关节软骨及软骨下骨有明显修复，CaLs评分较治疗前均有明显改善（P < 0.05）；治疗后1年及2年后软骨修复不明显，CaLs评分与治疗前比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

4 讨 论

KOA是一种多因素导致的慢性关节退行性病变，症状以膝关节疼痛、肿胀和活动受限为主，临床上以骨质增生、关节软骨损伤等为特点，是临床治疗的一个难题。关节软骨属于透明软骨，其内部无神经、血管及淋巴管的分布，未分化细胞无法进入损伤部位进行修复，而且软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中，限制了细胞的增殖和迁移能力，软骨细胞基质的合成能力有限，无法提供软骨修复所需要的营养。所以软骨一旦损伤无法生成透明软骨，只能够由纤维软骨修复；但纤维软骨的生物学、生物化学和生物力学特性与透明软骨有较大差别，在关节活动过程中很容易发生退变，进一步加速骨关节炎的进程。随着病程的进展，症状会逐渐加重，影响患者的工作和生活质量[1-2，8-9]。

及早的临床干预能延缓病情发展，改善膝关节功能，提高患者的生活质量。目前，治疗KOA的原则是缓解关节疼痛，保持并改善膝关节及下肢功能，临床治疗有药物保守治疗、物理治疗、膝关节置换手术等方法，但疗效差、疗程长、不良反应多、手术创伤大等一直困扰着医患。随着细胞生物理论的进展和对KOA病因病理研究的不断深入，许多临床医生采用细胞技术进行KOA的基础和临床研究，并取得了一定的效果[1-2，8，10]。

自体BMSCs生物技术广泛应用于KOA关节软骨缺损治疗领域，具有取材方便、无免疫排异反应、能够快速增殖、多次传代不会丧失其干细胞的特性、多向分化潜能、不涉及社会伦理和法律问题等优势[11-12]。国内外学者已做了大量研究，提示BMSCs在骨与软组织损伤修复方面有效。ZHOU等[13]用羟基磷灰石与自体BMSCs在体外培养72 h，植入兔关节软骨缺损处，术后16，32周处死，行病理形态学检查和Ⅱ型胶原免疫组化染色，发现形成完整的透明软骨及软骨下骨。ABBAS等[14]运用人BMSCs与软骨细胞在体外共同培养形成成熟关节软骨，且与周围正常关节软骨结合良好。

本次研究首先行关节镜清理清除损伤软骨面及炎性滑膜组织，可减轻关节炎性症状，阻止关节软骨面进一步磨损；磨损区软骨面钻孔提供良好的着床，同时刺激自体BMSCs聚集。注射的血小板裂解液中含有血管内皮细胞生长因子，可促进局部血管形成，增加局部血液供应，促进BMSCs向软骨细胞、成骨细胞转化。适当的关节轻柔不负重活动不仅不增加关节面的磨损，还有助于改善关节软骨的营养，舒展挛缩的关节周围软组织，促进修复。治疗后3个月与1年，WOMAC评分及VAS评分均有明显改善，提示自体BMSCs促进了软骨缺损面的修复，缓解了症状。但治疗后2年上述评分较治疗前改善不大，可能与骨关节炎持续发展，修复层进一步磨損有关，所以远期观察效果未确定，但BMSCs的使用明显延缓了软骨缺损的发展进程。治疗后3个月，磁共振显示可见新生类软骨生长，受损关节软骨及软骨下骨有明显修复，CaLs评分较治疗前均有明显改善；治疗后1年及2年后软骨修复不明显，CaLs评分与治疗前比较无改善。虽然患者症状改善明显，但是并无确切证据显示新生透明软骨能完全修复缺损，需要病理学进一步确认。

本研究表明，关节镜清理联合自体BMSCs移植能有效地促进早期KOA关节软骨的修复，从而改善膝关节功能，延缓KOA病程的发展；但后期治疗效果不明显，无法改变KOA的结局。本次研究为回顾性研究，样本量少，评价指标缺乏组织病理学评价，结果可能会存在偏倚，需要多中心大样本随机对照研究进一步验证。

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