BIM基因多态性对HBV感染相关性肝癌临床结局的影响

宋孝美，李青岭，郭进军

(1重庆医科大学生命科学研究院，重庆400016；2重庆医科大学附属第二医院；3重庆市急救医疗中心)

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一[1,2]，肝癌的发生是多因素、多基因、多步骤、环境和遗传因素共同作用的复杂过程,既往有研究表明个体遗传变异对疾病发生及预后有重要影响[3]。宿主基因多态性是决定个体遗传变异的重要方面。但目前尚无具体共识来阐释宿主基因多态性对肝癌临床结局的影响，大部分研究仍是小样本的横断面研究，缺乏长期动态随访观察来阐明宿主多态性与肝癌临床结局影响的相关性。BIM是Bcl-2家族的成员之一，具有凋亡活性，在自身免疫、维持造血稳态及肿瘤抑制方面均有作用。既往研究表明，BIM基因多态性在白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌发生发展中有重要作用[4～6]。通过抑制BIM基因的表达将会影响肿瘤进展及代谢。尚无研究BIM基因多态性与肝癌患者生存预后的影响。因此，我们探讨BIM基因多态性与HBV感染相关肝癌患者的生存期及临床结局的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年1月～2013年12月重庆医科大学附属第二医院诊断HBV感染相关性肝癌患者200例，纳入标准：①肝癌的诊断根据临床症状及生化指标诊断，且得到影像学CT或MRI证据或病理组织学检查结果；②治疗方法仅经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE)或支持治疗的患者。排除标准：①其他部位肿瘤转移到肝癌的患者；②合并人类免疫缺陷病毒或其他肝炎病毒(HAV、HCV、HDV和HEV)及其他非嗜肝病毒感染所致的肝病；③其他慢性肝病患者：如原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝病、酒精性肝病、药物性肝炎等；④严重心肾疾病及其他系统肿瘤患者。通过门诊、住院和电话相结合的方法进行随访，随访至2016年12月31日，从患者首次住院到死亡日或最一后次随访时间为患者生存期限，以月为计量单位。对于随访截止日仍存活的患者作为截尾值处理。排除生存时间小于1个月的患者，最终共纳入患者176例，男160例、女16例，年龄(52.67±12.13)岁。ALT 4.00～785.00 IU/L，AST 16.00～736.00 IU/L，TBIL 6.70～395.00 μmol/L，ALB 9.60～49.50 g/L，ALP 55.00～1 087.00 IU/L，GGT 9.00～1 296.00 IU/L，基线AFP<200 ng/mL者92例，≥200 ng/mL者84例，Child-Pugh 分级A级100例，B级50例，C级26例，肿瘤直径< 5 cm者108例，≥ 5 cm者68例，肝硬化140例，肿瘤数量单发134例，多发42例，抗病毒治疗112例，肿瘤复发42例，肿瘤肝内转移42例，多发转移52例，癌栓82例，HBV-DNA>104IU/L 60例。其中TACE患者106例(TACE组)，仅对症支持治疗患者70例(对照组)。中位生存时间1.0～70.0个月，平均19.7个月。本研究方案经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会审核通过，患者签署知情同意书。

1.2 研究方法 筛选候选基因，本课题组前期已经筛选出BIM基因的rs1877330、rs3761705、rs3761706、rs3789068、rs6727356、rs6746608、rs724710、rs3827537。对以上SNPs作哈温平衡检测，符合哈温平衡的rs1877330、rs3761706、rs3789068、rs6746608、rs724710、rs3827537作为对肝癌生存分析的候选基因。对入组的患者临床资料建立档案，通过门诊、住院和电话相结合的方法进行随访，详细询问患者出院后的后续治疗及临床结局，随访指标包括肝功能、两对半肝生化指标、HBV-DNA、甲胎蛋白、肝纤谱情况、影像学、抗病毒治疗情况、TACE治疗情况及临床结局。评价指标包括肿瘤大小、数量、转移及复发情况、门静脉癌栓情况、AFP变化趋势及肝功能情况。记录生存状态及生存时间。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。以患者首次住院至死亡日或至最后一次随访时间为患者生存期限，生存时间用中位数(范围)表示。年龄、性别、AST、ALT、GGT、ALP、白蛋白、胆红素、HBV-DNA的载量、基线AFP、肿瘤大小、数量、转移及复发情况、抗病毒情况、门静脉癌栓情况、TACE情况,AFP变化趋势及肝功能分级作为影响患者生存时间的候选因素，分别采用Kaplan-Meier 曲线及Log-Rank检验比较其生存差异，对有意义的单因素或临床认为有意义的单因素作COX回归多因素分析，分析每项因素的相对危险度及95%可信区间；用MDR分析SNP间的相互作用。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 176例HBV感染相关肝癌患者预后总生存期分析 单因素分析结果显示，rs761706 CC基因型较TC+TT基因型生存时间更长(P=0.016, 图1), rs724710 CT+TT基因型较CC基因型生存时间更长(P=0.008)。年龄越小(P=0.001)，基线ALT、AST水平越低(P分别为0.006、0.001)，ALB 越高(P=0.003)，HBV-DNA载量越低(P=0.021)，基线AFP越低(P<0.001)，Child-Pugh分级越低(P=0.01),抗病毒治疗(P<0.001)患者生存时间越长；肿瘤学的相关性分析结果显示，肿瘤直径越小(P<0.001),无癌栓(P<0.01),无转移(P<0.001)，治疗后AFP呈降低趋势，患者生存时间越长。多因素分析结果显示，rs761706 CC基因型是延长患者生存时间的独立因素(HR=3.913,95%CI1.150～13.315,P=0.016)，基线AFP越低(HR= 4.966,95%CI2.429～10.154,P=0.001),AST水平越低(HR=8.659,95%CI2.52～29.749,P=0.001),TB水平越低 (HR=3.203,95%CI1.325～7.746,P=0.01)，ALB水平越高(HR=2.874,95%CI1.298～6.363,P=0.009)，肿瘤越小(HR=3.881,95%CI1.690～8.912,P=0.01)，无癌栓(HR=13.715,95%CI2.335～80.565,P=0.04)患者生存时间越长。

图1 rs3761706、rs724710不同基因型HBV相关感染肝癌患者的生存曲线

2.2 TACE组患者生存期分析 TACE组患者中位生存时间1～71个月，平均26.1个月。截止到2016年12月31日，78例患者死亡(占73.6%)，其中男72例、女6例。单因素生存分析结果显示，rs761706 CC基因型较TC+TT基因型生存时间更长(P=0.043,图2)；rs724710 CT+TT基因型较CC基因型生存时间更长(P=0.003,图2)；rs3827537 TA+AA基因型较TT基因型生存时间更长(P=0.003,图2)，且基线AFP越低(P=0.001)，行抗病毒治疗(P=0.003)患者生存时间越长。肿瘤学的相关性分析结果显示，无门静脉癌栓(P=0.013)、肿瘤直径越小(P<0.001)，无转移(P=0.001),术后AFP降低(P=0.008)，患者生存时间越长。多因素分析结果显示，基线AFP (HR=16.507，95%CI3.504～89.213，P=0.001)，术后AFP变化趋势(HR=0.009，95%CI0.000～0.547，P=0.025)，肿瘤大小(HR=17.656，95%CI:5.248～59.406，P<0.001),ALB水平(HR=6.667，95%CI2.038～21.809，P=0.002)，TB水平(HR=10.473，95%CI1.063～103.109，P=0.044), 癌栓(HR=0.000，95%CI0.000～0.019，P=0.031)，rs3827537 T/A(HR=18.654，95%CI2.082～167.164，P=0.009)是影响患者生存率的独立危险因素。

2.3 对照组患者生存期分析 截止到2016年12月31日，对照组68例患者死亡(占97.1%)，其中男60例、女8例，中位生存时间1～49个月，平均10个月。单因素分析结果显示，rs761706 CC基因型较TC+TT基因型生存时间生存时间更长(P<0.001)，且年龄越小(P<0.001)、基线AFP水平越低(P=0.002)，ALT、AST、ALP、GGT、TB水平越低(P<0.001)，ALB水平越高(P<0.001)，患者生存时间越长。在肿瘤学的相关性分析中表明，无门静脉癌栓(P=0.001)、肿瘤直径越小(P=0.048)、无转移(P=0.002),患者生存时间越长。多因素分析结果显示，以上因素并非患者生存时间的独立危险因素。

图2 HBV相关感染的肝癌生存时间与rs3761706 C/C(T)、rs724710C/C(T)及rs3827537 T/A(T)关系的生存曲线

2.4 SNP之间的相互作用 由于rs3761706、rs724710、rs3827537在TACE组与对照组中差异有统计学意义。因此我们用MDR软件分析这三个SNP间的相互作用。发现三种重要的模型：①rs3827537；②rs724710-rs3827537；③rs3761706-rs724710-rs3827537。经过比较，最佳模型：rs3761706-rs724710-rs3827537(TBA=0.6147，CVC：10/10，P：0.012～0.013)。见表1。

表1 3种SNP间的相互作用比较

注：①检验平衡准确性；②交叉验证一致性；③1 000次置换检验计算后的P。

3 讨论

原发性肝癌是目前我国第三位的肿瘤致死病因[1]。肝癌发生是病毒、免疫和宿主基因之间的共同作用[7]。而宿主基因组多态性被认为是肝癌临床结局的关键因素，既往研究表明，某些宿主基因多态性与肝癌的发生相关[8～10]。

本研究中我们发现BIM rs3761706 CC等位基因，rs724710基因型CT+TT及rs3827537基因型TA+AA与延长肝癌患者生存时间有关。不同治疗方式的患者中，rs3761706基因多态性均是影响患者生存时间的危险因素。TACE组行单因素分析发现，rs724710 CT+TT基因型及rs3827537 TA+AA基因型与延长患者生存时间密切相关。多因素分析发现，rs3827537 TA+AA基因型是延长患者生存时间的独立因素。由于对照组患者数量相对较少，尚未在对症支持治疗中发现rs724710及rs3827537 基因多态性与患者生存时间的关系。对SNP进行MDR分析时，即使在1 000次置换检验之后，我们仍发现3个SNP(rs3761706、rs724710、rs3827537)相互作用差异有统计学意义。由此可见BIM基因多态性与HBV感染相关肝癌患者生存期有关，提示BIM基因多态性可作为肝癌患者的预后指标。这与既往研究提示BIM在多种肿瘤的发生发展过程中起重要作用结果一致[11]。

BIM基因是Bcl-2家族的促凋亡基因成员之一，被认为是T细胞的抑制基因，在防止自身免疫、炎症及肿瘤的发生中有重要作用[12]。BIM基因主要通过Bax,使线粒体释放细胞色素C，并且激活胱氨酸蛋白酶，最终导致细胞死亡[13]。BIM基因的表达在HBV相关感染肝癌患者中可调控细胞凋亡。而诱导细胞凋亡是肿瘤治疗的重要措施，因此可应用有效刺激诱导肿瘤细胞中BIM基因多态性表达上调。

TACE是一种介入治疗中晚期原发性肝癌患者的主要治疗方式。相比对症支持治疗，可有效延缓肝癌进展的速度，从而延长患者生存时间，是目前公认的中晚期患者首选治疗方法。TACE主要通过栓塞肿瘤供血的动脉，阻断肿瘤的血供，从而达到抑制肿瘤生长、促使肿瘤细胞坏死、凋亡的目的。本研究发现，TACE患者相对于对症支持治疗患者生存时间明显延长，且患者TACE次数越多，患者总生存期越长，该结果与既往Giannini等[14]的研究一致。本研究对比了106例TACE组患者及70例对照组患者的平均生存期、中位生存期及1年、3年、5年生存率，TACE组中位生存期及平均生存期明显长于对照组，而在1年、3年、5年生存率方面，TACE组亦较对照组有优势。在肝功能分级方面，肝功能分级与患者总生存期相关，差异有统计学意义。在亚组分析中尚未发现TACE及对照组患者中肝功能分级对总体生存率的影响，可能是由于样本数量相对较少导致。在TACE患者中,我们发现肿瘤的大小、基线AFP、ALB水平及TB水平是影响患者生存时间的独立危险因素。而在对照组中，尚未发现影响总生存率的独立危险因素，可能由于样本量太少所致。

综上所述，BIM rs3761706等位基因CC、rs724710基因型CA及rs3827537基因型TA有助于延长HBV感染相关肝癌患者总体生存率。同时本研究亦证实了TACE是肝癌患者的有效治疗方法，能明显延缓患者生存时间，且在TACE患者中，rs3827537 T/A作为影响患者生存期的独立因素，对于判断TACE患者的预后有指导意义。