miR-21对肝细胞缺氧复氧损伤的影响

王艳静，李恒力，许丙辉，刘昭明，张宪峰，夏时海

(1哈励逊国际和平医院，河北衡水053000；2哈励逊国际和平医院；3中国人民武装警察部队医学院)

肝癌是一种常见的肝脏原发性恶性肿瘤，预后较差。肝癌的发病受环境因素和遗传因素共同影响，其中肝脏缺血-再灌注损伤(IRI)为主要的病因之一[1]。IRI为在缺血的基础上恢复血流后，组织损伤反而加重，甚至产生不可逆性损伤的现象[2]。IRI的发病机较复杂，包括细胞内钙超载、炎性反应、氧化应激等，IRI可导致肝脏损伤，引起肝窦状细胞、肝细胞、胆管上皮细胞死亡，甚至造成患者死亡。缺氧复氧(H/R)的细胞模型能模拟IRI过程，当前在体外研究中较常见。PTEN又名MMA1或TEP1，属抑癌基因，可通过下调肿瘤相关信号传导通路实现肿瘤抑制，亦可抑制肿瘤细胞增殖、浸润转移[3]。PTEN是PI3K/AKT信号通路激活过程的负调控因子，其抑制肿瘤的主要机制是去磷酸化PIP3为PIP2，从而抑制PIK3的致癌活性，导致肿瘤细胞的侵袭和转移[4]。微小RNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的调控性小RNA分子，其中miRNA-21编码基因定位于跨膜蛋白(TMEM49)基因编码区域内，可参与细胞增殖、生长、发育、凋亡等生物过程，不过主要在转录后水平对基因表达发挥负调控作用[5]。PTEN是miRNA-21的下游靶基因且被其负向调控[6]，但在肝细胞缺氧复氧损伤中的应用尚无相关报道。2016年7月～2018年4月，本研究探讨了miR-21对肝细胞缺氧复氧损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2肝癌细胞系购于中国科学院上海细胞库，并已进行细胞株鉴定，保存于本科室。miR-21 mimic购自广州锐博生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；羊抗鼠PTEN、PI3K/、KT多克隆抗体与GAPDH内参抗体购自Santa Cruz 公司；Annexin V FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自Med Systems公司；所有引物与测定由英骏生物技术有限公司完成。

1.2 肝细胞缺氧复氧损伤模型的建立 HepG2细胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗的DMEM细胞培养液进行培养，细胞每48 h换液1次。取对数生长期的细胞，更换为不含糖、不含血清的DMEM培养液，放入MGC缺氧培养装置中培养12 h，更换培养液为含1O%胎牛血清的高糖型DMEM培养液，常规复氧培养6 h。

1.3 细胞分组与处理 将HepG2细胞随机分为4组，正常组、缺氧复氧组、miR-21 mimic处理组(实验组)、NC组，正常组不予任何处理，缺氧复氧组及实验组建立肝细胞缺氧复氧损伤模型，实验组在进行缺氧复氧前2 h，HepG2细胞内加入miR-21 mimic 100 nmol/L。NC组在缺氧复氧2 h前，加入等体积的无效miRNA。

1.4 miR-21表达检测 采用实时荧光定量RT-PCR法。收集各组的细胞，提取细胞总RNA，miR-21实时定量RT-PCR使用引物：正向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，反向引物：5′-GCGGTCAAGAGCAATAACGAA-3′。在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，以U6作为内参。

1.5 细胞存活率检测 采用CCK-8法。将HepG2细胞以5×104/mL的密度接种至96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，继续培养24 h。各组分别处理完毕后，每孔中加入1 μL的CCK-8检测试剂，培养2 h后使用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度，计算细胞存活率。

肝癌具有诊断困难、恶性程度高、发病初期症状不明显、病死率高等特点。在肝癌的发病过程中，多伴有IRI，其不仅可诱发肝功能异常、继发炎症反应和细胞凋亡等，亦是导致肝癌患者死亡的主要原因之一[7]。采用混合厌氧气体培养细胞建立缺氧复氧模型对细胞无潜在的化学损伤，能较好地模拟机体缺氧，当前应用较广泛[8]。肝细胞IRI是涉及诸多复杂级联反应的病理生理过程，包括活性氧、活性氮、中性粒细胞、血小板、细胞因子、凝血系统等激活。本研究结果显示，缺氧复氧组的细胞存活率低于正常组，LDH活性高于正常组，表明肝细胞缺氧复氧损伤模型建立成功。

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1.7 细胞中PTEN、AKT蛋白表达检测 采用Western blotting法。离心收集各组处理后的细胞，使用400 μL的RIPA裂解液进行裂解，12 000 r/min离心5 min，取上清蛋白进行BCA法测定浓度。SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，加一抗、4 ℃孵育过夜。二抗孵育后PBS清洗3次，每次5 min，最后曝光置于Odyssey荧光检测仪中，检测目的条带，使用GAPDH作为内参。

2.3 各组细胞凋亡率比较 实验组、NC组、缺氧复氧组、正常组细胞凋亡率分别为20.21%±1.73%、45.46%±1.63%、47.83%±1.45%、2.14%±0.33%，与正常组相比，缺氧复氧组、实验组、NC组的细胞凋亡率升高(P均<0.05)，其中缺氧复氧组的细胞凋亡率最高(P<0.05)。

2.4 各组PTEN、AKT蛋白表达比较 缺氧复氧组PTEN、AKT蛋白相对表达量分别为1.98±0.24、1.67±0.22，正常组PTEN、AKT蛋白相对表达量分别为0.14±0.09、1.11±0.42，缺氧复氧组PTEN、AKT蛋白表达高于正常组(P均<0.05)；实验组PTEN、AKT蛋白相对表达量分别为0.89±0.24、0.78±0.22，实验组PTEN、AKT蛋白表达低于缺氧复氧组(P均<0.05)。

2.2 各组细胞存活率与LDH活性对比 缺氧复氧组的细胞存活率低于正常组(P<0.05)，LDH活性高于正常组(P<0.05)；实验组的细胞存活率高于缺氧复氧组(P<0.05)，LDH活性低于缺氧复氧组(P<0.05)。见表1。

2 结果

2.1 各组miR-21表达比较 实验组、NC组、缺氧复氧组、正常组miR-21相对表达量分别为145.33±22.18、2.33±1.02、2.71±1.22、16.65±0.98，缺氧复氧组的miR-21表达量低于正常组(P<0.05)，实验组高于缺氧复氧组(P<0.05)。

(2)根据各系统模块提供的数据，自动计算水泥成本。具体为：根据人力资源管理系统数据，将管理费用等自动分摊到各个工序中；根据生产管理系统数据，分别计算水泥的不同配方和不同品种的产量，自动计算各水泥品种的生产成本。

表1 各组细胞存活率与LDH活性比较±s)

1.8 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 各组细胞处理完成后，取20 μL上清用于LDH活性测定。上清与检测工作液混匀后，37 ℃温浴2 h，室温放置5 h，在450 nm处测量吸光度值，计算各组样本培养上清中的LDH的活性。

首先以“剥落的墙皮”暗喻已经流逝的岁月，二者都有“无法回到最初状态”的特点。喻体墙皮剥落的过程正是本体岁月离开的最细节性的表现。

3 讨论

1.6 细胞凋亡检测 采用双染法。处理后的细胞用4 ℃预冷的PBS清洗，加入250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，取200 μL的细胞悬液，加入10 μL的Annexin联膜蛋白V-异硫氰酸荧光素+10 μL浓度20 μg/mL的碘化丙锭，避光孵育10 min，加入500 μL的PBS后上流式细胞仪分析。

miRNA是一类内源性的非编码小分子RNA，miRNA可与靶mRNA的3′非翻译区3′UTR结合，从而调控靶基因的表达。miR-21在染色体上的位置是17q23.1的FRA17B 区域上，miR-21基因具有高度保守性，可参与肿瘤的形成。在肝癌、胃癌、宫颈癌等细胞或组织中，miRNA-21表达均显著升高[9]，但目前尚无关于肝细胞IRI的miRNA表达谱及其变化的研究报道。本研究实时荧光定量PCR结果显示，缺氧复氧组的miR-21表达量低于正常组，实验组高于缺氧复氧组，差异有统计学意义，表明肝脏IRI伴有miR-21表达下降。

细胞存活率与细胞凋亡情况是反映细胞损伤程度的重要指标，细胞上清中的LDH活性变化反映细胞坏死程度。本研究结果显示，缺氧复氧组的细胞存活率低于正常组，LDH活性高于正常组；实验组的细胞存活率高于缺氧复氧组，LDH活性低于缺氧复氧组，差异有统计学意义；与正常组相比，缺氧复氧组、实验组、NC组细胞凋亡率升高，其中缺氧复氧组的细胞凋亡率最高，差异有统计学意义。从机制上分析，氧化应激被认为是导致器官IRI过程中细胞损伤的主要原因，缺血时器官氧气供应不足，之后的再灌注过程中氧气供应随之恢复，导致LDH的生成，从而破坏细胞结构的稳定性，并且可进一步诱发细胞凋亡，miR-21的加入增强了肝细胞对缺氧-复氧损伤的保护作用[10]。

PTEN名为与张力蛋白同源、第10染色体丢失的磷酸酶基因，有9个外显子和8个内含子，全长200 kb，有9个外显子和8个内含子[11]。PTEN蛋白定位于细胞质，呈网格状分布。PTEN是具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，其正常表达抑制肿瘤细胞侵袭、转移与生长[12]。PTEN基因在肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、乳腺癌等组织中的突变及失活均可通过下调肿瘤相关信号传导通路实现肿瘤抑制。PTEN的抑癌功能主要体现在参与PTEN/PI3K/Akt多条信号传导通路，发挥其诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、激活脂质磷酸酶与蛋白磷酸酶活性等作用[13]。PTEN的3′-UTR区含有miR-21的结合位点，PTEN被认为是miR-21的靶基因之一，抑制肝癌细胞中miR-21表达可使PTEN的表达增加，抑制细胞的增殖、转移与侵袭[14]。本研究结果显示，缺氧复氧组的PTEN、AKT蛋白表达高于正常组，实验组的PTEN、AKT蛋白表达低于缺氧复氧组，差异有统计学意义。表明miR-21在IRI发生发展中发挥致癌基因作用，可能通过抑制PTEN/PI3K/Akt蛋白表达调控调节细胞的增殖和凋亡[15，16]。

周教授说，我给你们讲啊，理论上讲就是真的了。一么，他们服装不像是演电影的服装，装备也不像演电影的装备，都是货真价实的。二么，他们的长相就是东方人的长相，东方人的长相我是专门研究过的么。这三么，他们打了我，你们想么，要是真演电影怎么可能那样真打我？这四么，要是真拍电影，怎么连摄影机都看不到？既然不拍，演了何用么？

综上所述，miR-21可抑制PTEN/PI3K/AKT信号通路，减轻缺氧复氧导致的肝细胞凋亡，提高肝细胞存活率，抑制LDH释放，从而减轻肝细胞损伤，但具体调控机制尚需进一步研究。