辽西奶牛乳房炎优势病原菌的分离鉴定及药敏试验

李 宁，程 迪，高 峰，马 强，张建平，董筱萍，刘英姿*

（1.辽宁省动物卫生监测预警中心，辽宁 沈阳 110001；2.大连晶泰医学检验所有限公司，辽宁 大连 116000；3.辽宁省北镇市动物检疫站，辽宁 北镇 121300；4.辽宁省锦州市义县动物疫病预防控制中心，辽宁 义县 121101；5.锦州医科大学畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121000）

奶牛乳房炎主要是由病原微生物引起的乳房实质和间质的炎症。该病自发现已有150多年的历史，至今仍是奶牛养殖业发病率高、经济损失严重的疾病之一[1]。患病奶牛乳房部位出现不同程度的组织病变，产奶数量和质量均有所降低，奶牛的生产性能和经济价值受到严重影响。该病病因复杂，生物因素是主要原因，且病原微生物种类较多，多项研究证实葡萄球菌，大肠杆菌，链球菌几种病原菌混合感染的情况逐渐增多[2-3]。多年来，抗生素仍是临床上首选的治疗方法，但不规范使用和过度依赖抗生素的情况导致细菌耐药性、奶中药物残留、奶牛自身的二重感染等问题逐渐增多[4]。本文针对辽西地区几个牛场中临床型奶牛乳房炎病例进行病原菌分离鉴定，并使用临床上常见的抗生素对优势菌株进行耐药性分析，旨在查明辽西地区临床型奶牛乳房炎的主要优势病原菌及其对常用抗生素的药物敏感性，为该地区针对奶牛乳房炎进行科学防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 脑心浸出液培养基、KF链球菌营养琼脂购自青岛海博生物有限技术公司；麦康凯营养琼脂、伊红美兰琼脂营养琼脂、MH琼脂培养基、哥伦比亚血琼脂基础购自北京陆桥生物技术有限公司。

1.1.2 试剂革兰氏染色液、生物梅里埃药敏试剂盒购自bio Merieux，sa；PCR Master Mix缓冲液购自北京全式金生物技术有限公司；DL 2000 Marker购自北京康为世纪生物科技有限公司；引物由上海生工生物有限公司合成。

1.2 样品采集在辽西5个市中，每个地区随机选取规模化奶牛场1～2个，依据农业部《奶牛乳房炎防治技术指南（试行）》（农医发[2010]29号）的规定作为奶牛乳房炎判定标准，选择患有临床型奶牛乳房炎并处于泌乳期的病牛作为样本对象。采集前先用温水清洗乳房，随后使用75%酒精进行消毒，弃去前两把乳汁。取适量乳汁放入15 mL灭菌离心管中，标记牛号和日期，放入冰盒，送回实验室。将奶样12 000 r/min离心2 min，弃去上清液，取沉淀加入适量脑心浸出液液体培养基中，37℃过夜培养。

1.3 传统方法分离鉴定病原菌用一次性接种棒挑取适量培养后的菌液划线于哥伦比亚血琼脂平板，37℃培养48 h后观察结果。取出现溶血环的菌落划线于KF链球菌营养琼脂和脑心浸出液固体培养基，并进行涂片，革兰氏染色镜检观察。在KF链球菌营养琼脂上生长良好且镜检结果为革兰阳性球菌，继续用KF链球菌营养琼脂纯培养；对于在KF链球菌营养琼脂上不生长的菌落，则使用脑心浸出液固体培养基进行纯培养；对于出现金黄色或黄色色素的菌落，则选择高盐甘露醇培养基进行纯培养；对于菌落较大、边缘不整齐且48 h后产生异味的菌落，划线于麦康凯培养基并镜检观察，反复纯化直至菌落纯净单一。其余形态和大小不同的菌落，均划线于BHI固体培养基，反复镜检纯化。50%甘油溶液1:1比例稀释菌液，-80℃保存菌株。

1.4 16SrRNA基因分析法鉴定细菌

1.4.1 提取细菌基因组从菌株冻存液中移取10 μL至5 mL BHI液体培养基，24 h过夜培养，复苏菌种。将复苏好的菌种按照《细菌基因组提取试剂盒》说明及步骤提取分离细菌基因组。

1.4.2 PCR扩增利用细菌16S rRNA基因序列中保守区设计引物如下：27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR扩增体系为30 μL：2×PCR Mix 15 μL， DNA 模 板 1 μL，10 mol/L 27F引物0.5 μL，10 mol/L 1492R引物 0.5 μL，ddH2O 13 μL。采用 Biometra Personal Cycler PCR仪进行PCR反应，反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环；72℃延伸7 min。4℃保存。

1.5 药敏试验使用生物梅里埃葡萄球菌药敏试剂盒ATB STAPH 5测试分离到的34株金黄色葡萄球菌对常用抗生素的耐药性；使用生物梅里埃肠道细菌药敏试验试剂盒ATB G-5测试分离的25株大肠杆菌耐药性；使用生物梅里埃肠球菌药敏试剂盒ATB Enteroc 5测试分离到的17株无乳链球菌耐药性。

2 结果与分析

2.1 传统方法分离鉴定主要细菌从89份临床型奶牛乳房炎奶样中共分离培养出13种细菌共103株。种类如下：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎克雷伯氏杆菌、芽孢杆菌、粪肠球菌、乳酸球菌、志贺杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、牛棒状杆菌等细菌。其中金黄色葡萄球菌34株，占33%；大肠杆菌25株，占24.3%；无乳链球菌10株，占9.7%。多数呈单一细菌感染，少部分样品呈混合细菌感染，多为金黄色葡萄与凝固酶阴性葡萄球菌混合感染。

2.216 SrRNA基因分析法鉴定细菌按上述PCR体系条件扩增，1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析，获得长度为1 500 bp的片段，与预期结果相符，详见图1。

图1 代表分离株16s rRNA序列测序结果Fig.1Sequencing result on separator 16s rRNA sequence

2.3 主要细菌的药敏试验结果辽西奶牛乳房炎无乳链球菌药敏结果见表1，该菌株对氨苄西林、万古霉素、利福平、替考拉宁敏感性高，为100%；四环素、链霉素次之，分别为70%和60%；对青霉素、环丙沙星耐药率较高，超过70%。辽西奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌药敏结果见表2，该菌株敏感率较高的药物有米诺环素、呋喃妥因、喹奴普汀、克林霉素；耐药率较高的药物有青霉素、苯唑西林、万古霉素、红霉素。辽西乳房炎大肠杆菌药敏结果见表3，该菌株敏感率较高的药物有头孢西丁、替卡西林；耐药率较高的药物依次为阿莫西林、头孢噻吩、环丙沙星、复方新诺明。

表1 无乳链球菌药敏试验结果Table 1Results of without Streptococcus Lactococcus drug sensitivity test %

表2 金黄色葡萄球菌药敏试验结果Table 2Results of Staphylococcus aureus drug sensitivity test %

表3 大肠杆菌药敏试验结果Table 3Results of E.coli drug sensitivity test %

3 讨论

3.1 本试验通过分离鉴定辽西地区临床型奶牛乳房炎的病原菌，结果显示该地区主要奶牛乳房炎病原菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和无乳链球菌。其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染占多数，是该地区奶牛乳房炎主要的病原菌；该地区分离到的链球菌均为单一的无乳链球菌，与其他地区报道的奶牛乳房炎链球菌为多种类型不同。

3.2 通过形态学观察和遗传学分析两个方法鉴定病原菌，两个方法的结果一致，传统鉴定细菌常结合形态学观察和生化分析，但生化分析受试剂和试验条件影响较大，存在结果不稳定的情况；而利用细菌的保守区域16s rRNA通过基因分析来鉴定细菌种属的方法已开始普遍应用，结果可靠且能够分析细菌遗传进化距离和关系[5]，可以进一步判断细菌传染来源和变异情况，为疫病防制提供更加详细的生物信息和可靠依据。

3.3 使用生物梅里埃药敏试剂盒对辽西地区奶牛乳房炎主要病原菌进行药敏试验，结果表明对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌对青霉素产生了高耐药性，而金黄色葡萄球菌和大肠杆菌对环丙沙星也同时产生了显著的耐药性；无乳链球菌对万古霉素高度敏感，但金黄色葡萄球菌对万古霉素却产生了高耐药性，同时金黄色葡萄球菌对红霉素、苯唑西林，大肠杆菌对阿莫西林、头孢噻吩、复方新诺明产生了耐药性。这与养殖场长期使用抗生素治疗奶牛乳房炎的现象有关，尤其是辽西地区的分离株对青霉素全部耐药，这与国内外的其他的报道结果相符。依据上述结果，青霉素和环丙沙星应该作为临床治疗奶牛乳房炎的淘汰药物[6-7]。

3.4 针对奶牛乳房炎病原微生物复杂，不同牛场分离菌存在差异，所以调查本地区奶牛乳房炎病原菌种类，筛选主要的流行菌株，明确菌株的耐药性，在治疗时有针对性地选择药物及交叉用药，适当结合中药，以达到最佳的治疗效果。此外，奶牛乳房炎的发病与饲养管理密切相关，防制奶牛乳房炎需遵循防大于治的原则，把控饲养管理等环境因素，采取综合防治措施，以达到有效预防。