鸡RB1基因多态性与腹脂性状的相关性

张 慧，于家强，那 威，徐梓纯

（农业部鸡遗传育种重点实验室，黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，东北农业大学动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

在现代肉鸡养殖业中，快大型肉鸡生长速度得到了明显的提高，然而，在肉鸡快速生长的同时，腹脂蓄积过多和腹水综合征等也随之产生，给肉鸡生产者带来了重大的经济损失[1-3]。其中脂腹脂沉积过多，不仅会降低肉仔鸡的饲料转化效率，减少分割肉产量，同时也会降低肉仔鸡的商品价格；另外过多的腹脂沉积在加工时会造成环境污染，并且影响禽类的产蛋率、受精率以及孵化率等[4-5]。因此，降低肉鸡腹脂沉积，控制脂肪在畜禽体内的过度沉积已成为是家禽遗传育种工作者亟需解决的问题。

本课题组柳晓峰等[6]以东北农业大学F2资源群体为研究材料，利用微卫星标记构建了鸡1号染色体连锁图谱，并对鸡1号染色体上控制体脂和体重性状的QTL进行了初步定位；并在此基础上又通过提高标记密度和扩大群体规模的方法对这些QTL进行了精细定位，结果将影响鸡体脂和体重性状的QTL分别定位于1号染色体3.7 Mb和5.5 Mb的区域内，并通过生物信息学分析鉴定出RB1基因等与鸡体脂性状相关的重要基因[7]。同时本课题组利用Realtime RT PCR的方法检测了RB1基因在东北农业大学高、低脂双向选择品系第十六世代1～7周龄鸡只腹部脂肪组织中的表达情况，结果发现RB1基因在高脂系中的表达量均低于高脂系，且在6、7周龄差异显著。综合以上结果，推测RB1基因可能与鸡脂肪组织生长发育的有关。

因此，本研究结合课题组前期的研究结果，以东北农业大学高、低脂双向选择品系第十一世代鸡只为试验材料，对鸡60K SNP芯片上位于RB1基因上的4个SNP位点进行多态性分析，进而分析与腹脂性状的相关性，确定RB1基因上影响鸡腹脂性状的重要突变位点，从而为深入研究RB1基因影响鸡脂肪组织生长发育的遗传机理提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料 高、低脂双向选择品系第十一世代鸡只共计475只雄性个体（低脂系203只，高脂系272只）。鸡群按常规商品肉鸡饲养程序统一进行饲养管理，7周龄时称量活重后屠宰，测定腹脂重，同时计算腹脂率（腹脂率=腹脂重/7周龄活重）。7周龄时翅静脉采血，苯酚-氯仿法提取基因组DNA后，-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 基因型分析将高、低脂系十一世代的475只

2.1 等位基因频率在高、低脂系间的差异比较RB1基因上4个SNP位点等位基因频率在高、低脂系间的差异，结果发现Gga_rs13552715、GGalu-GA054680和GGaluGA054691位点的等位基因频率在高、低脂系间存在显著差异（P＜0.05），而GGalu-GA054667位点的等位基因频率在高、低脂系间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 SN P多态性与腹脂性状的相关分析利用JMP 7.0软件进行SNP多态性与鸡腹脂重和腹脂率的相关分析，结果见表2。由表2可以看到，GGalu-GA054691位点多态性对腹脂重有显著影响（P＜0.05），Gga_rs13552715和GGaluGA054667位点多态性与腹脂重有一定程度的相关（P＜0.2）；GGalu-个体基因组DNA与鸡60K SNP芯片进行进行杂交，获得基因型数据。获得基因型数据后进行基因型质量控制，将杂交质量不好的位点去掉，最终在鸡RB1基因上有4个SNP位点的基因型可以用于后续统计分析。

1.2.2 统计分析根据试验材料的群体特点，利用JMP 7.0软件进行基因型与性状的关联分析，构建基因型效应分析的统计模型如下：

其中，Y为性状观测值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，L为品系固定效应，F（L）为品系内家系的随机效应，D（F，L）为家系与品系内母鸡的随机效应，e为随机效应。使用统计软件JMP 7.0检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。建议显著水平为P＜0.2，显著水平为P＜0.05，极显著水平为P＜0.01。

利用Haploview 4.1进行位点间的连锁不平衡分析。

2 结果与分析

表1 鸡RB1基因上4个SNP位点等位基因频率在高、低脂系间的差异Table 1The differences of allele frequency of 4 SNP loci in chickenRB1gene between the lean and fat lines

表2 鸡RB1基因上4个SNP多态性与腹脂重和腹脂率的相关分析结果（P值）Table 2association analysis between four SNPs of chickenRB1gene and abdominal fat weight and abdominal fat percentage

GA054691和Gga_rs13552715位点多态性对腹脂率有显著影响（P＜0.05），GGaluGA054667位点多态性与腹脂率有一定程度的相关（P＜0.2）；而GGalu-GA054680位点多态性与腹脂重和腹脂率的相关程度都没有达到显著水平（P＞0.2）。

2.3 连锁不平衡分析对鸡RB1基因上与腹脂性状有一定程度相关或显著相关的3个SNP位点进行连锁不平衡程度分析，结果发现Gga_rs13552715和GGaluGA054691位点处于强的连锁不平衡状态（r2=0.55＞0.3）（图1）。说明这两个位点可能连锁在一起发挥作用，对肉鸡腹脂沉积有重要的影响。

3 讨论

图1 鸡RB1基因上与腹脂性状相关的3个SNP位点的连锁不平衡情况Fig.1Linkage disequilibrium of three SNPs associated with abdominal fat traits in chickenRB1gene

RB1基因作为一个抑癌基因，因其在视网膜母细胞瘤中缺失而被发现[8]，与视网膜母细胞瘤密切有关，所以又叫视网膜母细胞瘤基因。RB1基因编码PRb蛋白，调控多个细胞进程[9]，包括细胞凋亡，细胞增殖，骨骼肌细胞、成骨细胞及脂肪细胞的分化等[10-12]。

3.1 PRb与细胞增殖PRb是染色质蛋白，其主要通过调控E2F转录因子来限制细胞周期相关基因的转录，达到对细胞周期负调控的目的[13]。在细胞周期的G1期到S期的过渡阶段，PRb被磷酸化，释放E2F，随后E2F激活细胞周期相关靶基因的转录，使细胞周期顺利进行。

3.2 PRb与细胞分化RB1基因可以对通过对特定基因的转录激活来调节细胞分化[14]。在人的内脏和皮下脂肪组织中，RB1（mRNA、蛋白和活性）与BMI（体重指数）和胰岛素抵抗呈负相关，但是与促进脂肪形成的基因的表达（PPARγ、IRS1）呈正相关。BMI增加主要是由于脂肪含量下降。RB1基因在人脂肪细胞分化过程中，蛋白质的表达量和活性都显著地增加。在完全分化的人脂肪细胞中，干扰RB1降低了脂肪细胞的成脂性[15]。Chen等[16]通过对小鼠的胚胎成纤维细胞的研究发现，体外培养条件下，有活性的PRb存在时，胚胎成纤维细胞可以分化成脂肪细胞；当PRb缺失时，胚胎成纤维细胞不能分化成脂肪细胞，而当使用野生型PRb转染缺失PRb的细胞时，小鼠胚胎成纤维细胞又能够分化成脂肪细胞。通过进一步的研究发现，产生上述现象的原因是小鼠成纤维细胞中PRb能激活C/EBPs家族介导的转录途径，从而诱导脂肪细胞分化过程。Classon等[17]在3T3成纤维细胞的研究中也发现随着PRb浓度的增加，C/EBPα介导的转录途径被激活，细胞进行分化，缺失PRb的3T3成纤维细胞分化受到严重阻碍。Cole等[18]在研究3T3-L1前脂肪细胞系时发现非磷酸化的PRb能够抑制C/EBPβ与DNA的结合活性，过表达PRb能够抑制C/EBPβ对C/EBPα的转录激活作用，进而抑制脂肪细胞分化。以上结果显示，RB1对脂肪细胞分化的调节在不同的细胞中可能具有不同的作用。鼠上，PRb不但对白色脂肪细胞的分化有很重要的作用，同时也是棕色脂肪细胞分化的负调控者[19-20]。实际上，鼠上的很多研究结果都显示，PRb的失活导致白色脂肪组织棕色化[21-23]。

3.3 PRb与肥胖高脂饮食会对下丘脑ARC（弓状核）造成损伤。ARC神经元在调节食物吸收及能量消耗方面发挥重要作用。下丘脑中的ARC包含2种神经元，POMC和AGRP/NPY，分别负调控和正调控能量平衡过程。研究中发现，在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，高脂饮食抑制PRb，从而解除PRb对E2F靶基因的抑制作用。在POMC神经元中，缺失RB1，导致细胞再进入细胞周期，细胞凋亡等过程的发生；但是在AGRP/NPY神经元，缺失RB1并没有影响。RB1在减少食欲的POMC神经元和增加食欲的AGRP/NPY神经元中的不同作用，为形成肥胖提供直接的依据[24]。

本研究中试验群体为东北农业大学高、低脂双向选择品系，这两个品系有共同的祖先，是通过对腹脂率和血浆中VLDL浓度的进行双向选择选育出来的。随着选择世代的增加，腹脂性状差异明显，理论上和腹脂性状有关的等位基因频率在高、低脂系间也会逐渐分离。本文中，比较RB1基因4个SNP位点等位基因频率在高、低脂系间的差异，结果发现，3个SNP位点的等位基因频率在高、低脂系间存在显著差异。

对RB1基因上4个SNP位点的多态性分析发现，其中的3个SNP位点多态性与腹脂重和腹脂率存在显著或一定程度的相关，进一步连锁不平衡分析发现两个位点处于强连锁不平衡状态，说明这两个位点可能连锁在一起，对肉鸡腹脂沉积有显著影响。综合群体遗传学分析结果以及相关分析结果，本研究通过试验证实，RB1基因确实是影响鸡腹脂沉积的重要基因。本研究结果为后续该基因影响鸡腹脂沉积的机制研究奠定了一定的基础。