纤维基组织工程支架结构对细胞行为的影响

李奇薇 李超婧 王富军,2* 丁 雯 胡思寒 王 璐,2

1(东华大学纺织学院，上海 201620)2(纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620)

引言

对于组织工程这种旨在帮助已被疾病、损伤、或先天性缺陷所破坏的组织再生[1]的技术，其内在的核心之一是设计和制造一种用于体外细胞接种或体内培养的支架，因此组织工程支架必须具有良好的生物相容性。生物相容性是指生物材料植入人体后能够保持适当细胞活性的能力，即适合细胞的黏附、增殖、分化和功能表达，同时也不会在体内引起明显的炎症反应、免疫原性和生物毒性[2]。为尽可能提高支架的生物相容性，了解材料对细胞的影响机制至关重要。

在体内，细胞生活在细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中。天然的细胞外基质由多种蛋白原纤维和交织在糖胺聚糖链水合网络中的纤维组成，其网络结构对组织细胞起到物理机械性支持作用；除此之外，还提供直接与细胞结合的生物活性肽序列，并通过细胞内信号级联向细胞膜受体传递信号[3]，最终引导细胞活动，包括增殖、分化、凋亡等。因此，对细胞/细胞外基质进一步了解，可能会使支架在植入时获得更佳的生物学活性。

支架的表面性能(如润湿性[4-5]、表面电荷、化学官能团[6]等)是影响细胞行为的重要因素之一。当植入物与生物环境接触时，立即发生蛋白质吸附(如血浆纤连蛋白)，而表面效应通常通过与细胞附着蛋白中RGD基序结合的整合素来介导细胞的黏附和增殖。通过表面改性等方法改变生物材料的表面能或润湿性，也就改变了细胞与表面相互作用，从而可以调控细胞的活动[7]。利用表面改性、接枝天然成分或者生物因子的方法，通常可以提高聚乳酸(polylactide，PLA)、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)等常用支架材料的生物相容性，除此之外还选用与壳聚糖、胶原等天然聚合物共混的方法。利用和体内ECM成分相似的天然分子所具有的亲水基团和其他官能团，可促进细胞黏附和增殖。支架常用的改性方法及其潜在应用如表1所示。

表1 支架常用的改性方法及其潜在应用Tab.1 The common modification of scaffolds and its potential applications

影响细胞行为的另一个关键是支架的物理结构特征。最近发展起来的表面图案技术为细胞-材料相互作用的基础科学研究提供了一种的独特方法：采用表面刻蚀、接触印刷等图案化技术，制备出微米尺度以及纳米尺度的凹槽[18]、脊[19]、柱[20]等有序结构和无规则表面(通常用粗糙度来表征)，或者进一步对结构表面进行改性，针对性地对单个影响因素的作用机制进行研究[21]。例如，Wan等发现，与平滑表面对照相比，微米尺度(2.2 μm)和纳米尺度(450 nm)凹坑的两个表面上的成骨细胞黏附增加，并且具有纳米凹坑的表面优于微孔表面[22]。同样地，当研究成骨细胞样MG-63细胞在钛表面黏附情况时，成骨细胞相比光滑表面较多比例地附着在粗糙表面；但是在研究牙龈和牙周韧带成纤维细胞和上皮细胞时，表明这两种细胞更易黏附到平滑钛表面上。两个结果也证实，不同细胞对不同尺度、拓扑结构的响应程度不同[23]。

纤维型支架可以从生化性能和物理结构两方面更好地模拟体内ECM，在组织工程应用中具有巨大的前景。在本综述中，主要论述常用制备纤维型支架的方法，即静电纺丝技术；尔后，还进一步分析通过该方法制备的支架的纤维结构对细胞行为的影响。

1 纤维结构对细胞行为的影响

目前有3种主要的制备纤维型支架的方法：静电纺丝、相分离[24]和自组装[25]。静电纺是一种在几何学、形态形貌学和生物化学方面制造模拟天然细胞外基质的工程化支架的常用技术[26]。静电纺技术在直径、密度、取向等方面易于调整，以获得优异的机械物理性能。制备的纤维支架因其较小的纤维直径所提供的高比表面积、高纵横比和高微孔性，所以具有增强细胞黏附、生长和分化的潜能。同时，高比表面积和孔隙率具有如下优点：提供可调节的流体吸收，药物和生物分子递送，保证足够的氧气及营养物质扩散，有效地去除代谢废物[27]。最新的研究表明，支架的纤维结构同样是调节细胞旁分泌功能的关键。例如，间充质干细胞(MSC)相比平板而言，在静电纺纤维支架上生长会产生更高水平的抗炎因子和促血管生成因子，增强MSC-支架构建体的治疗效果[28]。因此，静电纺纤维支架的设计成为组织再生领域(如脊髓损伤再生、神经修复、皮肤血管再生等方面)的研究热点之一。

纤维型支架的关键结构参数包括纤维直径，孔径和取向，会在不同尺度上影响及调节细胞活动(包括细胞的形态、迁移、增殖、分化和最终的组织重塑)。

1.1 纤维直径

黏附在纤维上的细胞受到纤维尺寸的影响，尤其是亚微米级到纳米级的纤维对增强细胞的黏附及增殖影响重大[2]。Tian等在聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)/胶原复合纳米纤维支架上接种NIH3T3成纤维细胞，纤维直径范围为500 nm～10 μm，发现与3～5 μm和10 μm等微米级的纤维相比，500 nm纤维上附着的细胞数量明显增多。这表明,微米尺度和纳米尺度结构的细胞-材料相互作用，其差异是显著的[29]。据文献报道，人的细胞在直径比自身尺寸小的纤维上可以更好地附着，成纤维细胞黏附和迁移所需的最小纤维直径以及成纤维细胞能桥接的最大纤维间距分别为10和200 nm[27]。因此，百纳米级范围内的纤维更类似于ECM纤维的尺寸(直径在10～300 nm之间)，从而有利于细胞的黏附和增殖。

纤维直径对细胞附着的影响还带来细胞形态的变化。当细胞在直径大于其自身的纤维上附着时可以在纤维表面完全扩散，相当于在二维平面上生长，通常表现为椭圆状；相反，当纤维黏附在小直径纤维上时，具有扩散性移动受体的细胞膜围绕具有相容配体的纤维缠绕，受体与配体的结合使细胞膜曲率增加，构象倾向于细长的纺锤形态(见图1(a)、(b))[29]。细胞处在纤维支架中又会受到纤维空间排列以及纤维间距的影响，使得对细胞形态的影响变得复杂。例如，Catherine等利用静电纺技术制备不同直径的PCL纤维支架，并在纤维表面涂覆层粘连蛋白后接种神经细胞，结果表明：细胞纤维在小直径纤维(平均直径为800 nm)上沿纤维分布并呈现多级形态，而在大直径纤维上(平均直径为10 μm)显示出细长的双极形态(纺锤形态)[30]。

1.2 孔结构

孔结构是影响细胞活动的另一重要因素，其大小会直接影响细胞的迁移，进而影响组织的重塑过程。通过静电纺技术制备纤维支架，其纤维直径会影响支架的孔径[31]。多个理论模型证明，支架的平均孔径随着纤维直径的增加而增加，因此研究孔结构对细胞影响时需要对静电纺纤维直径严格控制[32]。而相分离技术在控制支架的孔结构方面具有特殊的优势，利用冷冻干燥法与盐分离法或者与致孔剂结合，可以较为精确地控制孔径大小[33-34]。

Hu等使用冷冻干燥法制备了不同孔径(35～75 μm、75～100 μm)的PCL膜，在接种人脐静脉内皮细胞(HUVECs)后发现，相比平膜和小孔径膜，HUVECs在较大孔径的PCL膜上增殖能力得到增强[35]。除内皮细胞外，多种研究表明：5～15 μm的孔径适于成纤维细胞在支架上生长，40～100 μm适于骨细胞增长[36]。但是，支架的最佳孔径仍有争议，例如其他文献证明15～40 μm的孔径适合新骨的形成[37]，需要更多的数据支持。

通过上述举证可以发现，支架的孔径一般都为微米级，这是由于细胞的增殖需要足够的空间支持，若支架的孔径小于细胞直径，会限制细胞在支架内的迁移，并且可能形成二维组织，从而成为重建三维组织的障碍。因此，扩大支架的孔隙率与孔径成为静电纺技术的改进方向之一。

1.3 纤维取向

天然ECM纤维在空间上表现出不同程度的取向，例如肌腱中胶原纤维的取向在生长后期变得高度一致，并且除了肌腱组织外，包括韧带、肌肉、心脏、血管在内的多种组织都有取向的纤维构成，所以正确了解纤维取向对细胞的影响，对支架的发展是至关重要的。有研究证明，取向的纤维会对细胞组织和功能产生影响[38-39]。

Chiara等用离子交联剂制备出壳聚糖静电纺支架，在纤维随机和取向两种支架上培养C2C12成肌细胞系,结果表明:随机纤维支架上黏附的细胞要小于取向纤维支架上黏附的细胞；同时，取向纤维上的细胞具有良好的生物活力，且在培养时间内呈指数增长；随机纤维上的细胞在一半培养天数时的细胞数量比最终的细胞数量略有增加，但无明显差异[40]。另外，在PCL/胶原纤维上培养人类脂肪基质细胞(hASCs)，结果表明hASCs在取向的纤维上比随机纤维显示出更为细长的细胞形态、更高的增殖和迁移速率。同时，hASCs相关基因的表达在取向纤维上的合成能力更高[41]。这说明，细胞的黏附和增殖受到纤维取向的调控。

纤维的取向对细胞形态的影响也受纤维直径的影响。较大直径纤维上的细胞方向与纤维的取向一致，而在较小直径纤维上的细胞与纤维的取向有较大偏差，其形态与随机纤维上的细胞类似，这是由于细胞通常黏附在多根纤维上，所以细胞在纤维上常呈现簇状生长(见图1(c)～(e))[1]。细胞形态的不同导致细胞的迁移速度不同，纺锤形态的细胞迁移最快(约50 μm/h)，多边形态的细胞迁移最慢(约20 μm/h)[42]。

除此之外，不同空间排列的纤维支架通过改变细胞形态以及细胞骨架上的张力影响细胞的分化[43]。例如，间充质干细胞(MSC)在随机纤维上更多地形成软骨组织以及随后的组织骨化，而在取向纤维上细胞多分化成肌腱组织[44]。

图1 细胞在不同纤维表面的形态示意。(a)细胞在单根小直径纤维上呈纺锤体形态；(b)细胞在单根大直径纤维上完全铺展呈椭圆状；(c)细胞在随机纤维表面呈多极形态；(d)细胞在取向纤维表面呈纺锤形态；(e)细胞在密集的取向纤维表面呈多极形态Fig.1 Schematic illustration of cytoskeletal arrangements on different fiber structures.(a)Cells appear spindle-shaped on a single small diameter fiber;(b)Cells appear fully spread on a single large diameter fiber;(c) Cells exhibit multipolar morphology on the surface of the random fibers; (d) Cells are spindle-shaped on aligned fibers (e) Cells exhibit a multipolar morphology on the surface of the dense aligned fibers

2 采用静电纺技术制备不同的纤维结构

静电纺在过去10年中得到了广泛的发展，并以其低成本性、易操作性和参数可调性成为制备不同结构支架的常用方法。虽然静电纺丝是一个相对简单的过程，但许多变量影响纤维的结构，这些影响因素主要包括聚合物溶液性能(导电性、表面张力、黏度、分子量、流速等)、加工参数(流速、喷丝头与接收装置之间的距离、电压等)以及环境因素(温度、湿度等)，这些影响因素之间的协同相互作用对静电纺丝纤维的结构产生了强烈的影响。为扩展静电纺支架在生物医用领域的应用，通常对静电纺技术进行改进或者同其他技术复合，从而得到精确、可控的纤维结构。

2.1 取向纤维结构

制备取向纤维结构最常用的方法是采用滚筒收集装置(见图2(a))，通过调整滚筒转速及喷丝距离可以得到取向良好的纤维结构[45]。虽然这种技术在生产高度取向的纤维方面运行良好，但是滚筒转速除影响纤维取向度外还影响纤维的直径，一般来讲纤维直径与旋转速度成反比，且无法对纤维间距进行控制，所以通过滚筒制备的支架的应用范围受到限制[46]。

采用辅助电场来精确地控制静电纺丝的过程，也可以制备取向的纤维或交叉排列的纤维结构(见图2(b))。也就是说，通过控制阳极和阴极之间宏观电场的形状和强度，以抑制喷射流的不稳定性[1]。Lisa等利用辅助电极的方法对聚酰亚胺和可生物降解的聚合物PGA进行静电纺，制备出高度取向的纤维，直径约为10 μm，纤维间距在25～30 μm之间；而PGA取向纤维的直径约为500 nm，纤维间距为7～10 μm[47]。根据这个原理，还可以利用导电电极的间隙排列来制备取向纤维[48]。

图2 制备取向纤维的静电纺示意。(a)利用滚筒接收装置制备取向纤维；(b)利用辅助电极制备取向纤维Fig.2 Schematic illustration of aligned fiber produced by electrospinning. (a)Columnar collectors method; (b)Incorporating auxiliary electrodes method

2.2 大孔径纤维结构

静电纺纤维支架的小尺寸倾向所带来的孔径过小的现象会限制细胞在支架内迁移。为克服这个问题，常见的方法是利用盐浸渍法的原理，在制备双组分支架后去除单个组分，以产生多孔构造[49-50]，但是这种方法易受到另一个组分浸出的影响，而且支架的稳定性在浸出后发生变化。改用液体收集装置进行静电纺，也可形成大孔径的三维纤维支架(见图3)。相比于空气，纤维在液体中的沉积密度降低，从而形成较大的孔隙[11]。Lin等将滚筒收集装置一半浸于水中，经过静电纺制备出三维取向的聚L-乳酸/聚丙烯腈(Poly(L-lactide)/Polyacrylonitrile，PLLA/PAN)复合支架，这使得在该支架上面培养人间充质干细胞(hMSC)的增殖和存活力显著改善[51]。

图3 采用液体收集装置的静电纺示意。(a)制备随机多孔纤维支架；(b)制备取向多孔纤维支架Fig.3 Schematic illustration of liquid-collecting electrospinning setups. (a)Production of random fibrous scaffold; (b)Production of aligned fibrous scaffold

除了改变接收装置外，制备多孔支架的另外一种方法是结合其他技术，如激光。利用高激光能量引起纤维的快速加热、熔化和蒸发，在静电纺纤维上产生期望的几何图案，如凹槽或基质孔[52]。Javier等在制备含有纳米羟基磷灰石的PCL纤维膜上用激光处理，产生了70～100 μm的孔洞，提高了其生物活性[53]。

除此之外，通过使用更高的聚合物浓度或改变溶剂组成、增加纤维直径来扩大孔径的方法也是非常普遍的[50, 54]。纤维直径的增加虽然扩大了支架的孔隙率以促进细胞浸润，但可能对细胞附着和生长具有负面影响。为此，Wu等利用动态液体系统和双喷嘴共同静电纺两种技术，制备由纳米纤维聚集而成的静电纺纱线(直径为10～19 μm)，这种静电纺纱线与纳米纤维相比具有更好的机械性能、更高的孔隙率和更大的孔径，促进了平滑肌细胞的增殖和迁移[55]。

2.3 多尺度复合结构

在多尺度纤维支架中，纳米尺度的纤维可以为细胞附着和生长提供了有利的表面形态，而微米尺度的纤维能够为细胞迁移提供足够的空间，同时也可增强支架的力学性能，成为组织工程支架的新型设计方向。多尺度复合结构支架主要通过两种及以上技术配合进行设计，比如溶液静电纺与熔融静电纺的结合，还有三维(3D)生物印刷技术与静电纺的结合来制备新型3D支架。

熔融静电纺虽然应用不广，但是纺丝体系中不含有溶剂，不存在溶剂挥发不干净的问题，所以溶液与熔体静电纺丝的组合在制备多尺度复合结构支架方面具有一定的优势。Kim等将装有聚合物溶液及聚合物熔体的两个喷丝头安放在相对的位置上，面向同一个接收装置同时纺丝，制备出多尺度PLGA复合支架，在人表皮成纤维细胞(NHEF)和人表皮角化细胞(NHEK)相容性评价中，复合结构支架比微米级支架更能促进细胞的增长[56]。

3D打印是一种利用添加剂等材料快速定型的技术，可以在微米范围内制造出可调控的、复杂的个性化支架，常用的几种3D打印包括生物绘图(bioplotting)、喷墨生物印刷(inkjet bioprinting)、选择性激光照射(selective laser sintering, SLS)、立体光刻(stereolithography, SL)和熔融沉积建模(fused deposition modeling, FDM)，已有学者对3D打印技术在组织再生领域的应用进行综述[57]。3D打印与静电纺的结合，既可以实现个性化的支架设计，又可以利用纳米纤维特性提高支架的生物相容性。Lee等利用立体光刻的方法，将PCL纳米纤维嵌入到3D印刷水凝胶支架中，结果表明与无纳米纤维支架相比，复合结构支架明显改善了神经干细胞的黏附，同时具有取向结构的复合结构支架增强了细胞的增殖[58]。

利用具有图案化表面的接收装置，在电场分布环境下可以相应地影响纤维沉积，制备出独特的纤维结构(见图4)，会产生更好的机械强度并诱导特异性细胞反应[59]。Mahjour等在静电纺丝过程中将含胶原的电纺丝纳米纤维收集到不锈钢金属网的表面上，制备出纤维密度从密集到松散分布、周期性交替的纤维支架，其中密集区域内的纤维保持结构完整性，而松散分布区域内允许细胞穿透，改善了细胞的扩散[60]。同时，纤维密集区域和松散的纤维区域之间的不同纤维结构也诱导成纤维细胞的不同形态(星状与细长的纺锤状)。采取不同图案的模板也可以制备出不同的形状的支架[61]，为支架的设计提供了新的思路。

图4 模板接收装置静电纺示意Fig.4 Schematic illustration of pattern-collecting electrospinning process

3 结论与展望

通过静电纺技术制备出纤维型支架，可以模拟天然ECM的结构特点，在组织工程领域具有广阔的发展前景。本文综述了不同纤维支架结构对细胞行为的影响，具有类似于ECM纤维尺寸的支架可以增强细胞的黏附和增殖，同时不同大小的孔径、不同的空间排列也会影响细胞形态、分化、迁移等行为。但是，限于现有静电纺等制备技术的发展水平，难以得到精确控制的支架结构；同时细胞具有自己独特的性能，对不同材料、不同尺度的纤维响应不同，这使得更加细致、深入的研究面临巨大的困难。

总而言之，纤维支架与细胞相互作用机制的研究不仅可以为支架的设计提供新思路，而且还可以通过与其他因素结合来调控细胞活动。例如，结合材料的化学性质设计出更大应用规模的组织工程支架，这对组织再生领域的推进极为有利，同时还可以促进它在新材料以及生物传感器等领域的发展。