间质性膀胱炎膀胱平滑肌RhoA/Rho激酶表达与胶原分泌的关系

叶雪挺 陈洪德 翁志梁

间质性膀胱炎（IC）临床表现复杂多样，储尿期症状较重的患者常伴随膀胱有效容量的降低，可能与膀胱纤维化及低顺应性膀胱的形成相关。有研究认为［1］在膀胱纤维化过程中，组织中胶原蛋白特别是Ⅰ型胶原蛋白合成增加。有研究表明，RhoA/Rho激酶在人类和动物的膀胱平滑肌功能与结构方面起重要调节作用［2］。前期研究［3］显示在IC大鼠模型中RhoA/Rho激酶途径可能增加膀胱逼尿肌收缩的敏感性，从而参与IC的发生、发展。且Rho激酶可能参与调控心肌的纤维化［4］。有文献报道［5］RhoA /Rho激酶通路与小鼠左心室重构有关，Rho激酶可促进小鼠心肌纤维化，长期抑制Rho激酶可显著改善心室重构。本文探讨IC患者膀胱平滑肌组织中RhoA/Rho激酶、I型胶原表达情况及相关性。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2012年10月至2016年12月本院IC患者24例（观察组），其中男5例，女19例；平均年龄（49.3±11.4）岁。平均病程（74.6±16.4）个月。诊断符合美国糖尿病、消化及肾病协会（NIDDK）制定的IC诊断标准［6］。排除糖尿病、高血压、精神病史、肝肾功能损害、膀胱相关感染性、免疫性疾病。根据盆腔疼痛和尿频、尿急患者症状调查表评分（PUF评分），≤15分12例为低症状评分组；PUF评分＞15分12例为高症状评分组。另收集同期12例输尿管膀胱再植手术患者正常膀胱组织为对照组，其中男2例，女10例，平均年龄（50.4±12.8）岁。与观察组比较年龄无统计学意义（P＞0.05），所有入选患者均知情同意。

1.2 方法 （1）标本采集：观察组硬脊膜外麻醉下行膀胱注水扩张时取膀胱组织活检，活检部位远离溃疡处。对照组为所取正常膀胱组织。将所取膀胱组织修剪为0.5cm×0.5cm×0.5cm的平滑肌组织，用生理盐水冲洗后放入冻存管，迅速转移至液氮内保存。（2）试剂及设备： TRIzol总RNA抽提试剂盒：美国MRC公司。逆转录试剂盒：美国Promega公司。实时荧光定量PCR试剂盒：美国Promega公司，Rotor-Gene 3000实时PCR检测仪：澳大利亚Corbett Research公司。人Ⅰ型胶原蛋白、RHoA蛋白、ROCK I蛋白ELISA试剂盒：美国TSZ公司。PBS缓冲液：北京中杉生物技术公司。ELX800酶标仪：美国Bio-Tek公 司。（3）RT-PCR检 测 RhoA mRNA、ROCK I mRNA水平：①总RNA提取：膀胱平滑肌组织按照TRIzol提取总RNA，用分光光度计测定纯度。②合成DNA：按逆转录试剂盒说明书操作合成，RhoA上游引物为5'-CTGGTTGGGAATAAGAAGGAT-3'，下 游 引 物 为5'-CAGCAAGGTTTCACAAGACA-3'，产 物 大 小253bp；ROCK I上 游 引 物 为5'-AACTGATGGTAACCTCCCAGAGT-3'， 下 游引 物 为5'-GGATTGCTCCTTATCTTGTTCG-3'，产 物 大 小 159bp。β-actin上 游 引 物 为5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，下游引物为5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，产物大小 211bp。③分别扩增RhoA、ROCK I与β-actin：94℃变性

1min，52℃退火45s，72℃延伸1min，40个循环，最后72℃延伸7min。每一反应至少重复进行3次。④标准曲线制作：分别取各组逆转录后cDNA为模板，以10倍浓度梯度稀释后分别行PCR反应。分析扩增曲线数据，获取溶解曲线及定量标准曲线。⑤结果判断：根据Ct值从标准曲线上读取待测基因表达水平，并以此表达水平与参照物表达水平之比作为样品中待测基因的相对表达水平。（4）ELISA法测定RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白含量：称取膀胱平滑肌组织500mg，匀浆后将匀浆物于4℃，12000r/min离心10min。分别收集上清液-70℃冰箱保存，用于标本含量测定。检测操作步骤严格按ELISA试剂盒说明书进行。采用酶标仪于450nm处读取OD值，通过标准曲线获得待测样本RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达水平。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，Levene检验法检验各总体方差齐性，方差不齐时采用Welch法进行校正。方差齐时各组间两两比较采用Bonferroni检验，方差不齐时各组间两两比较采用Games-Howell检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

三组间RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达水平差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。三组间RhoA mRNA两两比较显示对照组与低症状评分组间差异无统计学意义（P=0.093），高症状评分组与对照组、低症状评分组间差异有统计学意义（P＜0.01）。ROCK I mRNA两两比较显示对照组与低症状评分组组间差异无统计学意义（P=0.590），高症状评分组与对照组、低症状评分组差异有统计学意义（P＜0.01）。RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白两两比较差异均有统计学意义（P＜0.01）。采用Pearson相关分析法计算RhoA mRNA与ROCK I mRNA 的相关系数 r=0.590（P＜0.01），RHoA 蛋白与ROCK I蛋白的相关系数r=0.737（P＜0.01），RHoA蛋白与Ⅰ型胶原蛋白的相关系数r=0.783（P＜0.01），ROCK I蛋白与Ⅰ型胶原蛋白的相关系数r=0.736（P＜0.01）。

表1 三组RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达水平（x±s）

3 讨论

IC的发病机制至今尚未明确，临床症状复杂多样，尿频、尿急、盆腔痛及夜尿增多等症状较常见。临床上部分症状较重的患者行尿动力学检查时发现膀胱顺应性降低，膀胱最大容量减小的现象［7］，推测与膀胱纤维化有关。上述现象的出现，用目前被多数学者接受的膀胱上皮通透性异常假说尚难以解释。近年来，有研究发现［8］RhoA/Rho激酶途径在调节大鼠及人类膀胱逼尿肌收缩中起重要作用。当细胞接受到信号刺激时，激活胞质内的RhoA，进而激活其下游的Rho激酶。Rho激酶又称为Rho相关激酶（ROCK），是RhoA下游最主要 、最具特色的效应器［9］，存在着多种磷酸化和去磷酸化的作用，有ROCK I和ROCK II两个亚型，研究［10］表明，在内脏平滑肌组织中主要起作用的是ROCK I。ROCK I激活后可抑制肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）活性，提高肌球蛋白ATP酶的活性，改变调节性蛋白对钙离子的敏感性，增强平滑肌的收缩敏感性［11］。除此以外，ROCK I激活后还可以通过抑制一氧化氮的产生、抑制神经血管再修复等可能途径导致膀胱过度活动［12］。

膀胱平滑肌组织纤维化是膀胱功能由代偿向失代偿转变的重要过程。近年来有研究［13］表明，RhoA/Rho激酶途径与心肌纤维化相关。小分子Rho酶家族除增加平滑肌细胞收缩敏感性外，也可参与调节细胞的迁移、聚集、粘附、增殖等功能。有研究发现［4］，Rho激酶可能参与调控大鼠心肌肥厚与血管平滑肌肥大，另有文献［5］指出RhoA/Rho激酶途径与小鼠心血管重构及心肌梗死后的左心室重构有关，特异性抑制剂抑制Rho激酶后可改善重构程度。应用基因敲除技术，有研究［14］认为Rho激酶的同源异构体形式ROCK1在心肌纤维化中起重要作用。根据以上研究结果，作者推测RhoA/Rho激酶途径可能与IC疾病进展过程中的膀胱纤维化相关。本资料结果显示，对照组、低症状评分组、高症状评分组组间RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达水平均有显著性差异，RhoA mRNA与ROCK I mRNA、RHoA蛋白与ROCK I蛋白、RHoA蛋白与Ⅰ型胶原蛋白、ROCK I蛋白与Ⅰ型胶原蛋白间均存在正相关。提示IC患者存在膀胱平滑肌组织纤维化现象，且纤维化程度与临床症状水平相关，临床症状水平越高，纤维化程度也越重。在纤维化过程中明显上调RhoA mRNA、ROCK I mRNA、RHoA蛋白、ROCK I蛋白的表达水平，提示IC患者膀胱纤维化过程中RhoA/Rho激酶途径被活化。推测IC患者膀胱纤维化至少部分是通过RhoA/Rho激酶信号通路介导的。

当然RhoA/Rho激酶信号通路可能不是IC患者膀胱纤维化过程中唯一参与的信号转导通路。在心肌纤维化的研究中，有学者指出酪氨酸激酶途径、转化生长因子β（TGF-β）均可能参与引起心肌纤维化［15］。IC患者膀胱纤维化是一个复杂的过程，还有那些信号通路、信号转导因子参与其中，有待进一步研究。