胺碘酮增加α-SMA表达诱导肺A549细胞上皮-间质转化机制研究

陈皓 黄时伟 朱宁 吴悠扬 邹贺 姜文兵

胺碘酮是预防及治疗恶性室性心律失常的有效药物，但会产生严重的副作用。既往报道，在胺碘酮治疗的患者中，肺毒性发生率从1%～10%不等，即使是在低剂量情况下［1］。当胺碘酮诱导的肺纤维化（AIPF）被明确诊断时，为避免呼吸衰竭，立即停用并尽快降低胺碘酮的血药浓度及皮质醇激素的强化治疗被报道是有效的［2］，但在AIPF早期未被确诊的患者将死于不可逆转的呼吸衰竭。因此，阐明该机制并防范AIPF的发生和发展至关重要。本文探讨胺碘酮诱导肺泡基底上皮细胞（A549）上皮-间质转化（EMT）的机制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）化学制品：胺碘酮购自江莱生物科技有限公司（上海）。胎牛血清，胰蛋白酶和Dulbecco改良的Eargle培养基购自Life Technologies（Grand Island，NY，USA）。肺 A549 细胞购自 ATCC（Rockville，MD，USA）。兔抗α-SMA 抗体购自Abcam（Cambridge，MA，USA）。Alexa Fluor 488和594缀合的抗兔IgG抗 体 购 自 Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。（2）细胞培养物：人肺泡上皮腺癌细胞系A549购自中国科学院（上海）。将A549细胞在含有10%胎牛血清（FBS），抗生素（100IU / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）的DMEM的25cm2培养瓶和6孔培养板中在37℃，5%CO2的培养箱。当细胞达到80%融合时，用PBS洗涤，然后用0.25%胰蛋白酶消化细胞，从培养瓶中收集细胞，离心弃上清液，最后悬浮于完全培养基中，接种于塑料培养皿中。对所有实验，将细胞传代培养到6孔板中并维持直至亚汇合（80%），并在添加胺碘酮前将细胞血清剥夺24h。

1.2 方法 （1）免疫细胞化学分析：将A549细胞在6孔培养板中培养。为检测α-SMA，将细胞在PBS中冲洗，然后在室温（RT）下在4%多聚甲醛（PFA）中固定15min，用PBS冲洗5min，重复3次。然后加入含有0.01%Tween-20的10%牛血清白蛋白（BSA）并温育2h以合并在RT处的非特异性结合。将细胞与α-SMA（1：150稀释）的一级抗体在4℃温育过夜。第2天用PBS洗涤细胞。使用的二抗是Alexa Fluor 488或594-缀合的抗 - 兔IgG抗体（稀释度1：200），在黑暗中温育2h。最后，将细胞在PBS中冲洗，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育核染色10min。用配备荧光的相差显微镜（Nikon，Japan）拍摄荧光图像。（2）Northern印迹分析：根据制造商的说明，使用Trizol试剂从A549细胞中提取总RNA。通过在260nm处的紫外吸收的分光光度测量来量化RNA。且通过在1.5%琼脂糖凝胶上可视化28S和18S条带来证实RNA完整性。使用RT-PCR试剂盒通过逆转录使用RNA样品合成cDNA。设计的引物和已发表论文的确定引物被用于RT-PCR。用于该分析的α-SMA引物的序列如下：正向：5'-TGGCTGATGGAGTACTTC-3'和 反 向：5'-GATAGAGAAGCCAGGATG-3'。GAPDH被用作内部控制。GAPDH引物的序列如下：正向：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和 反 向：5'-AACGGTAGTGTCTTTGTGA-3'。对于RT-PCR反应，PCR混合物在20μl终体积的SYBR主混合物（Invitrogen） 中 含 有 cDNA（1μl） 和 引 物（2μl）。94℃反应15min，94℃反应45s；55℃反应48s，72℃反应48s，共30个循环。PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上运行。所有RT-PCR产物均表达相对于内部对照的基因表达的百分比变化。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，采用多因素方差分析，Tukey多重比较检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞化学分析肺A549细胞中α-SMA的表达 相差显微镜观察A549细胞形态为立方形鹅卵石。在A549中微弱观察到α-SMA（间充质标记）（见图1A）。应用胺碘酮50μM（见图1B）、100μM、150μM处理A549 72 h，采用免疫细胞化学方法检测α-SMA的表达。与对照组比较，细胞外观转变成纤维细胞样，长而窄，纺锤形形态，提示α-SMA的高表达（见图1C、D）。结果表明胺碘酮可以诱导A549细胞中的EMT样表型。

图1 胺碘酮诱导的A549细胞系中α-SMA表达的剂量依赖性（400×）。将A549细胞在0．1%FBS培养基中与胺碘酮50μM（图B），100μM（图C），150μM（图D）培育72h。免疫细胞化学分析显示，与对照组（图A）相比，胺碘酮对A549细胞的α-SMA表达呈剂量依赖性增加。随着胺碘酮剂量的增加，上皮鹅卵石形态逐渐转变成纤维样细胞样形态。上皮细胞标志物EMT标记α-SMA（绿色：A-D）；细胞核用DAPI（蓝色）染色

2.2 胺碘酮对A549细胞EMT标志物表达的剂量依赖性变化 前期研究，A549细胞表现出对150μM胺碘酮作用72h的EMT，通过显著增加间充质标记物α-SMA的表达，从其上皮表型转变成成纤维细胞样形态。将A549细胞与50μM，100μM和150μM胺碘酮温育72h。免疫细胞化学分析表明，上皮鹅卵石形态在一定剂量下逐渐转变成纤维样细胞样形态。且A549细胞标记物间充质细胞标记物α-SMA增加（见图 1）。

2.3 实时RT-PCR分析胺碘酮在A549细胞中表达EMT标志物 见表1、2。

表1 各组α-SMA mRNA不同时间点不同剂量间表达的比较（x±s）

表2 各组α-SMA不同时间点不同剂量间表达的比较（x±s）

3 讨论

特发性肺纤维化是以成纤维细胞和肌成纤维细胞群和细胞外基质定位扩张为特征的致命性肺部疾病。肺纤维化与上皮依赖性成纤维细胞活化过程有关。其特征是成纤维细胞、肌成纤维细胞和细胞外基质（ECM）的积累，最终导致肺结构的瘢痕形成和破坏。成纤维细胞和肌成纤维细胞灶被认为是IPF发病的中心特征。IPF中成纤维细胞和肌成纤维细胞的来源仍不完全清楚。迄今为止，已经提出肌成纤维细胞通过至少三种可能来源积累：驻留的肺成纤维细胞或间充质前体的增殖；骨髓来源的纤维细胞或循环祖细胞转化成成纤维细胞和上皮 - 间质转化（EMT），其中肺泡上皮细胞（AEC）经历向（肌）成纤维细胞的转变［3］。也有文献表明EMT是IPF中成纤维细胞和肌成纤维细胞的重要起源［4］。EMT是上皮细胞逐渐丧失其上皮功能和特征并转化为获得间充质细胞特征的间充质样细胞的过程。在EMT过程中，上皮细胞失去顶端基底极性，基底膜附着和细胞 - 细胞连接，上皮表型逐渐获得间充质标志物（α- SMA，波形蛋白，N-钙粘蛋白）。经历EMT的细胞导致成纤维细胞增殖并将成纤维细胞转化成合成和沉积ECM成分的成肌纤维细胞。现在越来越多的研究表明（肌）成纤维细胞确实可以通过EMT从上皮细胞衍生出来，并可能导致肺纤维化的发生［5］。几项研究报道，一些药物可以诱导EMT引起肺纤维化，如甲氨喋呤（MTX），博来霉素（BLM）［6-7］。然而，目前还没有关于肺泡上皮细胞是否在AIPF中经历相同EMT的数据。

本研究结果表明，胺碘酮可以通过EMT（肺纤维化的一部分）诱导肺A549细胞的纤维化反应。作者观察到胺碘酮治疗的肺A549细胞通过EMT的形态学改变与特发性肺纤维化非常相似。从这些发现中得出结论，至少在一定程度上，EMT可能在胺碘酮诱导的肺纤维化进展中起关键作用。

在过去几年中，越来越多的证据表明，IPF可能是由复发性肺泡上皮细胞（AECs）损伤引起的，初始损伤导致AECs的异常活化，并随之导致形成成纤维细胞病灶，这被认为是纤维化的活性部位［8］。众所周知，胺碘酮及其代谢物对不同类型的细胞具有直接和间接毒性［9］。AECs与肺纤维化有关胺碘酮细胞毒性的关系仍不清楚。作者观察到胺碘酮可引起肺纤维化，并导致肺A549细胞减少和肌成纤维细胞增殖。本研究结果表明胺碘酮诱导上皮细胞的细胞毒性和纤维化中的成纤维细胞的增殖。因此，肺A549细胞比成纤维细胞更易受到细胞损伤。

Willis等在2005年鉴定IPF患者肺组织中常见表达的上皮标志物和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），表明细胞在IPF肺中发生表型转换并首次描述EMT参与人肺纤维化过程的可能性［10］。在2006年，Kim［11］报道AECs是体内成纤维细胞的祖细胞，而ECM是纤维形成过程中EMT的关键调节因子。Xi及其同事指出，美多环素可通过抑制EMT抑制纤维化，进一步支持EMT信号在肺纤维化中的作用［12］。因此，越来越多的证据表明肺成纤维细胞和肌成纤维细胞可能通过EMT从上皮细胞中获得。为阐明胺碘酮是否能诱导肺泡上皮细胞的EMT。经胺碘酮刺激后，肺泡上皮细胞呈纤维状，长而窄，呈梭形，细胞间低度接触。作者观察到胺碘酮可以通过免疫细胞化学分析增加α-SMA的表达，从而通过EMT诱导肺纤维化。进一步发现α-SMA在肺A549细胞中的表达增加具有剂量依赖性和时间依赖性。

总之，胺碘酮通过增加α-SMA表达诱导肺A549细胞上皮-间质转化，可能是胺碘酮诱发肺纤维化的重要促纤维化因子。EMT可能是胺碘酮诱导肺纤维化的重要步骤。因此，本研究预计会产生新的药物发现，用于预防药物诱导的纤维化，并为寻找仍然未被证实的肺纤维化机制提供线索。