白三叶对新疆秋季自然降温的生理响应

李 倩，王玉祥，张 博

(新疆农业大学 草业与环境科学学院/西部干旱荒漠区草地资源与生态实验室，新疆 乌鲁木齐 830052)

白三叶(Trifoliumrepens)是我国大面积种植的富含蛋白质，营养丰富的优质牧草。白三叶草姿美、色翠绿、绿色期长，也是草坪草的骨干草种之一[1]。新疆野生白三叶是优良的牧草资源，具有抗病耐热、抗寒、耐旱且耐盐碱等特点[2]。白三叶不仅具有生长范围广、易于种植、便于管理等优点，而且有优越的固氮性能，使其对草地畜牧业的发展和维持草地生态系统的稳定都具有重要作用。

由于城镇现代化的快速发展，大量的开发和开采土地，导致地表植被无表土层保护，直接暴露于光照下，使其蒸发加强，温度变化剧烈。持续低温会使植物发生冻害，严重时甚至死亡。低温损伤是影响植物生产的主要原因之一，因此，探索植物抗寒性的生理机制在基础理论和实际生产上具有重要现实意义。

新疆农业大学草业科学系经过10多年的栽培驯化，从新疆北疆地区20多个县市的野生白三叶种质材料中选育出综合性能较好的多个白三叶新种质。为了进一步探寻白三叶在自然降温条件下生理生化指标的变化规律，试验以选育的4个新种质A、B、C、D为材料，以海法(Trifoliumrepenscv.haifa，E)作为对照，在秋季自然降温过程中取样观测叶片相对含水量、叶绿素、丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖的含量和膜质透性等指标的变化，探寻自然降温对白三叶生长发育的影响，为进一步开展白三叶新种质的抗寒性研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验地概况

试验地设在新疆乌鲁木齐市三坪农场草业试验站，该站属中温带大陆性半干旱气候，光照资源丰富，月平均气温24.5℃，年降水量180 mm，年平均蒸发量1 780 mm，年均日照时数2 900 h，年均大于10℃的积温3 500℃，无霜期为170～180 d。

1.2 试验设计

以白三叶乌市南山(A)和(B)、昌吉(C)、呼图壁(D)为供试材料，海法为对照(E)，海法为国外引进品种(表1)。2014年3月采用营养体移栽方式从呼图壁草地生态站野生资源圃移栽到新疆农业大学三坪农场草业试验站，每个种质3个小区，小区面积3 m×5 m，行距30 cm，株距10 cm，深度3 cm。

试验于2015年8月17日开始取样，9月26日结束，每隔10 d取样1次，共取样5次，取各植株展开的成熟叶片的中叶，3个小区进行混合取样，重复3次，同时记录取样前3 d的平均温度。取样期间，田间温度呈现逐渐降低的趋势，取样前3 d的平均温度依次是28.0℃(T1，8月17日)、16.5℃(T2，8月27日)、13.0℃(T3，9月6日)、9.0℃(T4，9月16日)、6.5℃(T5，9月26日)。每次取完的样品立即放入液氮中保存，用以生理指标的测定。

表1 参试材料信息

1.3 测量内容与方法

采用烘干法测量白三叶顶部叶片的相对含水量[3]、采用SPAD-502测定叶绿素含量、硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[4]、蒽酮比色法测定可溶性糖[5]、磺基水杨酸-酸性茚三酮比色法测定游离脯氨酸含量[6]、电导率法测定膜质透性[3]。

1.4 数据处理

利用SPSS 19.0和Excel 2010软件进行相关数据的处理和作图。

2 结果与分析

2.1 降温对叶片含水量的影响

自然降温对白三叶叶片的相对含水量影响较大，随着自然温度的逐渐降低，5个品种的叶片含水量均呈现逐渐下降的趋势。其中，当温度从28.0℃逐渐降低到16.5℃时，5个白三叶的叶片含水量均有升高，在整个自然降温过程中，D、E的叶片含水量在6.5℃时比9℃时高，种质B在16.5℃叶片含水量较高，达到83.41%。种质A在28.0℃下降到13.0℃过程中，叶片含水量变化不大(P<0.05),但温度降到9℃和6.5℃时，与其他处理差异显著(P<0.05)。白三叶叶片含水量在温度16.5℃时高于其他(高温和低温)处理(表2)。

表2 自然降温下白三叶叶片的含水量

注：不同字母表示同一种质各温度变化差异显著(P<0.05)，下同

2.2 降温对叶绿素含量的影响

自然降温对5个白三叶的叶绿素含量均有影响，随着温度的降低，其变化趋势一致。其中，A和B呈现逐渐降低的趋势；C、D和对照E的变化晚于A、B 10 d，呈现逐渐降低的趋势；种质不同叶绿素含量变化幅度不同。A，B，C和D的叶绿色含量在温度从13.0℃降低到9.0℃的过程中变化幅度均较大，而E在此温度下变化不明显，但是E在8月17～8月27日，温度从9.0℃降低到6.5℃时叶绿素含量突然下降，相比在16.5℃时候叶绿素含量下降29.30%，说明低于9.0℃可能使E失绿，相对其他种质来说，对照E对温度的下降比较敏感。通过对试验数据进一步分析表明，种质A，B和C在温度从13.0℃下降到9.0℃时，叶绿素含量下降幅度最大，下降比例分别为13.10%，17.20%和19.01%，5个种质整个降温过程叶绿素的变化幅度分别为26.36%、30.01%、27.36%、26.89%、29.26%。所有种质在温度为16.5℃时，叶绿素含量最高(表3)，说明温度在16.5℃时，有利于白三叶生长以及叶绿素的积累。种质A、B的叶绿素含量普遍高于其他种质。

2.3 降温对丙二醛含量的影响

MDA是植物在逆境胁迫下产生的一种膜脂过氧化物，其含量的多少可以反应出膜脂过氧化物的大小，即受损害程度的大小[7-10]。低温胁迫，破坏了细胞膜，使细胞通透性增加造成物质流失。随着温度的降低，各种质的丙二醛含量均呈现逐渐增加的趋势，在5个温度变化下，D、E种质的变化趋势大于其他3个种质，2个种质在温度从16.5℃降低到13.0℃时，丙二醛含量快速升高；种质E在温度降低到6.5℃时又有一个快速变化点，说明种质E对温度变化比较敏感。当温度从28.0℃下降到6.5℃，各种质的变化幅度分别是56.81%、56.33%、56.86%、62.02%、65.24%。对照种质E的丙二醛含量相比种质A高2～3倍，说明对照组E的受伤害程度较大。A，B和C的MDA含量较低，变化幅度较小，说明叶片在温度变化时，对温度感应较敏感，生物膜受到的破坏在自身承受范围内，损害程度较小(表4)。

表3 自然降温下白三叶叶片的叶绿素含量

2.4 降温对可溶性糖含量的影响

可溶性糖是植物的主要渗透调节剂，也是合成其他有机溶剂的碳架和能量来源，对细胞膜和原生质胶体起稳定作用。低温胁迫通过影响增加细胞膜的通透性，使电解质外渗，营养物质流失，从而使可溶性糖含量相应增加。同一种质在自然降温过程中，可溶性糖含量显著上升，试验在5个温度处理下，各种质的变化幅度分别是61.71%、60.24%、50.02%、56.03%、58.01%，A、B的变化幅度较大，可溶性糖含量也相对其他种质较高，A的可溶性糖含量比对照E高出大约一倍(表5)。

表4 自然降温对三叶叶片的丙二醛含量的影响

表5 自然降温下白三叶叶片的可溶性糖含量

2.5 降温对游离脯氨酸含量的影响

游离脯氨酸作为渗透调节物质，在逆境胁迫条件下,许多植物体内脯氨酸大量积累。积累的脯氨酸除了作为植物细胞质内渗透调节物质外,还在稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒以及作为能量库调节细胞氧化还原势等方面起重要作用。试验中，在自然降温条件下，植物体内脯氨酸的含量显著增加。脯氨酸对低温的反应常随着低温程度的不同而异，在较低的长期低温下，脯氨酸的增加是植物伤害的结果，而在无严重冷害的锻炼温度下，脯氨酸的积累则是一种适应性反应。5个种质随着温度降低，游离脯氨酸含量均逐渐增加。温度从16.5℃下降到13.0℃时，游离脯氨酸变化幅度最大。在28.0℃和16.5℃时，A的游离脯氨酸含量相比对照组高了2倍；在13.0，9.0和6.5℃，A的游离脯氨酸含量高出对照组E约4倍。在5个温度处理下，各种质的游离脯氨酸含量总体表现为A>B>C>D>E，变化幅度分别为83.87%、74.97%、78.04、75.75%、71.32%。在9月初自然降温过程中，低温胁迫进一步加大，叶片中的游离脯氨酸含量急剧增加(表6)。

表6 自然降温下白三叶的游离脯氨酸含量

2.6 降温对电导率的影响

细胞膜是活细胞与环境之间的界面与屏障，各种不良环境对植物的影响首先作用于细胞膜，改变其透性，细胞膜透性大小反映出细胞质膜受害程度。细胞膜结构和功能的紊乱和膜透性的变化是逆境胁迫作用的关键所在[11]。电导率越大，细胞膜透性越大，植物抗寒能力就越小[12]。

同一种质在不同温度下的电导率呈现先减小后增加的趋势,不同温度下各个种质的变化幅度各不相同，5个不同温度处理下，电导率变化幅度依次为30.06%、28.13%、29.57%、33.57%、39.52%。B的电导率变化最小，说明植物体内营养物质流失较少，细胞对温度的胁迫的破坏抵御能力较好，使膜脂透性减小(表7)。

表7 自然降温下白三叶的电导率

3 讨论

在自然降温过程中，白三叶各项生理指标发生显著变化。5份白三叶种质的叶片相对含水量在逆境胁迫下呈现降低的趋势，这与李亚萍等[13]的研究结果类似。研究表明，不同材料对生理指标的响应不同，呈现出不同的变化规律[14]，与研究不同品系的生理指标变化幅度也不同，抗寒性较强的品种下降趋势较缓慢的结果相一致。低温使叶片含水量降低[15]，减少细胞内外结冰，以增加其抗寒性[16]。由此说明，当温度持续降低时，抗寒性种质的保水能力较强，水分损失较少。

增加可溶性糖含量可提高植物细胞的渗透调节能力，增加胞内溶质浓度，增强植物抗冻能力。秦文斌等[17]在甘蓝中研究表明，低温处理下，随着处理时间的延长 4种甘蓝的可溶性糖含量均有所增加,且耐寒品种的增加幅度较大[17]，与研究结果一致。对白三叶抗寒性的研究表明，当自然温度降至8～2℃时，白三叶的可溶性糖含量出现不同程度的下降，随着温度的逐渐降低，白三叶可溶性糖含量出现升降交替的变化[18]。试验只研究了自然降温过程中28.0～6.5℃的5个梯度，并没有研究0℃以下的可溶性糖含量，在持续低温胁迫下，白三叶可溶性糖含量的变化规律有待进一步探究。

植物冻害与膜脂过氧化紧密相关，MDA是膜脂过氧化的最终产物，MDA与蛋白质结合后对质膜有毒害作用，MDA的含量一定程度上反映了耐寒性的强弱[19]。游离脯氨酸是植物耐寒性强弱的重要生理指标之一，也是植物细胞内重要的渗透调节物质，其含量的增加有利于细胞持水和生物大分子的稳定。在发生低温、干旱、盐渍等非生物胁迫时,大部分植物均会积累大量的脯氨酸[20],来保持细胞持水和生物大分子结构的稳定性,适应逆境。朱丽芳等[21]报道脯氨酸是植物逆境胁迫的产物，逆境环境会引起植物体内脯氨酸含量增加,这与此次研究结果一致。

研究结果发现在温度降低至13.0℃时，丙二醛、可溶性糖、游离脯氨酸含量均显著增加，其中，电导率的变化趋势是先减少后增加，表明体内细胞受到较为严重的破坏，这与高婷婷[22]研究结果一致，随着温度的降低，其膜脂过氧化程度逐渐增加、细胞或组织大量脱水、细胞质膜透性增大[23]，电解质外渗，白三叶受温度变化的危害程度逐渐增大[24]，但是未超过白三叶自身调节范围。

4 结论

随着自然温度的降低，叶片含水量逐渐降低，种质A的叶片含水量变幅最大，下降幅度为11.23%；在16.5℃各种质的叶片含水量均达到最大值。叶片叶绿素含量变化呈降低趋势，且种质C、D和对照E的叶绿素变化晚于A、B种质10 d；整个降温过程中，丙二醛、可溶性糖和游离脯氨酸含量均呈现逐渐增加的趋势，但对照E的丙二醛含量相比种质A高出2～3倍，D在6.5℃时丙二醛含量达到最大，为29.02 μmol/g；A的可溶性糖含量比对照E高出大约1倍，A的可溶性糖含量在6.5℃时最高，达到40.42 μg/g；A的游离脯氨酸含量比对照组高出2～4倍，A的游离脯氨酸在6.5℃最高，为189.23 μg/g，而E的游离脯氨酸在28℃时最小，仅有11.61 μg/g；电导率则呈现先减小后增加的趋势，在16.5℃时5个白三叶种质的电导率均最低，A电导率在16.5℃时低至22.83%。综合分析得出，在5个白三叶种质中，A、B对降温的耐受性优于其他种质。