5株植物根际促生菌对紫花苜蓿生长 和品质的影响

李昌宁，李政璇，曹全熙，李建宏，姚拓，冉福，冯影

(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业 可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省外资项目管理办公室，甘肃 兰州 730030；3.和政县农业技术推广站，甘肃 临夏 731299)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界各国广泛种植的优良豆科牧草，具有生长快、生物量大和对不良环境适应性强等特性，应用前景非常广阔[1]。紫花苜蓿作为我国畜牧业供给侧结构性改革发展的一种重要饲草，近年来种植面积不断增加，另一方面，紫花苜蓿虽然具有与根瘤菌共生结瘤固氮的能力，但其生物固氮过程也需要磷素的参与，因此，其种植过程对磷肥的需求量较高，磷矿是一种不可再生资源，我国磷矿储量少，严重依赖国外进口，大量的磷肥使用在增加紫花苜蓿生产成本的同时，对食品及环境安全也带来隐患，还会导致土壤板结、肥力下降、作物的收益率减少、甚至耕地退化，单靠化肥来提高苜蓿的产量已不能满足可持续发展的理念需求[2]。据2013年统计，我国的化肥年使用量已达4 637万t，占世界化肥施用总量的35%。按播种面积计算，平均化肥使用量达到400 kg/hm2，是美国的4倍，是发达国家化肥安全施用上限(225 kg/hm2)的2倍，另一方面，我国的化肥有效利用率很低，每年农用化肥的60%～70%进入环境[3]。2015年全国化肥用量为6 022.6万t，与2013年相比，化肥年均增长率为14.9%，农业部2015年2月出台了“到2020年化肥使用量零增长行动方案”，因此，以微生物肥源替代化肥的研究引起了研究者的广泛关注，其中植物根际促生细菌(Plant growth promoting rhizobacteria，简称PGPR)的研究已成为国内外研究热点之一[4-6]。

植物根际促生菌是指自由生活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、防治病害、增加作物产量、改良土壤的细菌[7-8]。李丹等[9]使用含有PGPR的菌肥可使黄瓜产量提高85.3%、维生素C含量提高36.6%，畸形率降低42.4%；使用微生物肥料后，可增加烟草株高，降低病虫害，增加经济效益[10]；土壤中水分含量、有机质、速效氮、有效磷和有效钾的含量会增加，土壤微生物的数量也会增加[11]。虽然苜蓿根系有大量的根瘤可为其提供一定的氮素营养，但对磷素依赖性较大，目前苜蓿生产的磷肥年使用量为900 kg/hm2，有的高达1 350 kg/hm2，且磷素是苜蓿结根瘤的必需元素，直接影响到根瘤数量及固氮效率[12]。PGPR可以把土壤中不能被植物利用的无机磷转化为植物能利用的有机磷，促进植物营养元素的供应和生长[13]。

微生物肥料研制与应用我国始于20世纪40年代，首次在大豆根部接种根瘤菌；50年代早期研究了根瘤菌在内的固氮菌、硅酸盐细菌等细菌性肥料；60年代推出了“5406”放线菌抗生菌肥料；70～80年代中期研究土壤真菌制成的孢囊；90年代后，逐渐出现溶磷、解钾、促生和生防等产品[14]。试验利用课题组前期筛选出的PGPR菌株为材料，以盆栽方式验证其对苜蓿生长和品质的影响，以期为PGPR的应用和推广提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 Gnyt1、Jm92、Lx191、LSH11、Jm170等均为课题组前期研究中积累的优良菌株材料，其特性见表1。

表1 菌株特性

1.1.2 供试苜蓿种子 供试紫花苜蓿品种为甘农三号，种子市售。

1.1.3 供试土壤 供试土壤采挖自甘肃省农业科学院试验田，加入少量蛭石备用。将准备好的混有蛭石的土壤过3 mm的土壤筛，辐照灭菌(委托兰州绿源辐照有限责任公司完成)，装入已消毒的花盆(直径18 cm，深19 cm)备用。

1.2 试验设计

试验为分别接种Jm92、Lx191、LSH11、Jm170、Gnyt1菌液和灭菌的溶菌肉汤(LB)培养液(CK)共6个处理，每个处理4次重复。挑选饱满、无破损的种子，30%双氧水表面消毒5 min，无菌水浸泡2 h，然后置于25℃培养箱内催芽处理，发芽后挑选长势一致的幼苗进行栽培。每盆栽培15株，栽培7 d后选择长势一致的幼苗，每盆留苗10株。将活化后的菌株接种于LB培养液，180 r/min，28℃培养，血球计数板检验菌体浓度，培养36 h，待菌体浓度达到108cfu/mL时终止培养，用移液枪吸取培养液，滴加到幼苗根部，每苗加2 mL，置于室温、自然光下培养，定期浇水。待种子成熟期测定植株的株高、茎粗及粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的含量。

1.3 测定项目及方法

株高采用卷尺测定，以土壤到枝条最高处的绝对高度表示[19]；茎粗采用游标卡尺测定，以茎基部距土壤5 cm处的粗度表示[19]。待种子成熟期，距土壤5 cm处将花盆内10株苜蓿全部刈割，放置于烘箱121℃杀青30 min，60℃干燥48 h至恒重后，用粉碎机粉碎并过100目筛网，粉碎后混合均匀，对苜蓿营养品质进行测定，粗蛋白采用半微量凯氏定氮法测定；粗脂肪采用索氏抽提法测定；酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维采用范式纤维素法测定[20]。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，用Excel 2010软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 植物根际促生菌对苜蓿生长的影响

促生菌株对苜蓿株高的影响十分明显，与对照相比株高增加11.2%～75.2%(图1)。不同菌株促生能力大小不同，促生菌剂处理的苜蓿株高都有不同程度的增加(P<0.05)。不同促生菌剂处理对苜蓿株高影响的大小顺序为Gnyt1>Jm92>Lx191>LSH11>Jm170>CK，菌株Gnyt1、Jm92对苜蓿株高的促进作用极为明显(P<0.05)，分别是CK的75.2%、59.6%，表明Gnyt1、Jm92能够明显促进苜蓿的株高。其次是菌株Lx191，使株高增加30.0%。

菌株可增加苜蓿茎粗4.1%～22.2%，对苜蓿茎粗的影响趋势和株高类似(图2)，但没有株高明显。使用不同促生菌剂后，对茎粗的影响各不相同。除Jm92与Lx191之间差异不显著外(P>0.05)，其余各处理均差异显著(P<0.05)，各菌剂处理对苜蓿茎粗促进效果最明显的是Gnyt1，较CK增加22.2%；Jm92、Lx191与Jm170次之，增幅分别为15.6%、14.0%、8.7%；而菌剂Jm170处理效果最差，茎粗较CK增加4.1%。

图1 接种菌株处理下苜蓿的株高Fig.1 The effect of PGPR strain on plant height

图2 接种菌株处理下苜蓿的茎粗Fig.2 The effect of PGPR strain on stem diameter

2.2 菌株对苜蓿品质的影响

各菌剂处理均能提高苜蓿粗蛋白含量(图3)，粗蛋白含量在19.3%～21.9%，比对照增加15.3%～20.1%。不同菌剂对苜蓿粗蛋白影响的大小顺序为Gnyt1>LSH11>Jm170>Lx191>Jm92>CK，各处理间差异显著(P<0.05)。经菌剂Gnyt1处理的苜蓿对粗蛋白促进作用最明显，与CK相比增加20.1%，其次，由LSH11，Lx191和Jm170处理，粗蛋白含量分别增加了15.3%，11.2%和11.8%，而Jm92处理的粗蛋白含量增加6.0%，效果最弱。

各菌剂处理的苜蓿粗脂肪含量均有明显提高(图4)，粗脂肪含量增加3.8%～12.7%(P<0.05)。其中Gnyt1处理效果最好，与对照相比提高12.7%(P<0.05)；其次是Jm92和LSH11，分别提高10.0%、9.4%；而Jm170和Lx191较弱，分别提高5.9%和3.8%。

图3 接种菌株处理下苜蓿的粗蛋白含量Fig.3 The effect of PGPR strains on crude protein content

图4 接种菌株处理下苜蓿的粗脂肪含量Fig.4 The effect of PGPR strains on crude fat content

各菌剂处理对NDF抑制作用显著(图5)，NDF含量在40.2～41.5，各菌剂较CK减少1.4%～4.4%(P<0.05)，其中Gnyt1，LSH11和Jm170较对照相比抑制作用明显，减少量分别为4.4%，3.3%和3.0%，而Jm92和Lx191较弱，减少量分别为2.1%、1.4%。不同菌剂对苜蓿NDF抑制作用的大小顺序为Gnyt1>LSH11>Jm170>Jm92>Lx191>CK，各菌剂处理均能抑制苜蓿NDF的形成，提高苜蓿品质。

经促生菌剂处理后苜蓿的ADF含量明显减少，ADF含量为27.5%～28.2%(图6)，减少17.5%～37.8%。不同菌剂处理对苜蓿ADF含量减少的大小顺序为Gnyt1>Jm92>Jm170>LSH11>Lx191>CK，Gnyt1、Jm92对苜蓿ADF减少作用明显，分别减少了37.8%、35.5%；其次是Jm170和LSH11处理的苜蓿，减少22.0%、21.4%；而Lx191对ADF减少量为17.5%，减少作用较弱。

图5 接种菌株处理下苜蓿的NDF含量Fig.5 The effect of PGPR strains on NDF content

图6 接种菌株处理下苜蓿的ADF含量Fig.6 The effect of PGPR strains on ADF content

3 讨论

3.1 菌株对苜蓿株高和茎粗的影响

试验所用的PGPR菌株对苜蓿株高和茎粗均有促进作用(P<0.05)，株高和茎粗分别增加11.2%～75.2%、4.1%～22.2%。菌株对苜蓿茎粗的影响趋势和株高类似，但没有株高明显。这是由于植物的生长尤其是苜蓿，其伸长生长的幅度要远远大于横向生长，总体而言，研究采用的5株促生菌促进苜蓿株高和茎粗是协同增长。施用PGPR菌剂后，不仅使定殖在植物根际的PGPR菌群数量大幅增加，其代谢过程中分泌的乳酸、延胡索酸、苹果酸等降低了土壤局部的pH，使一些难溶性磷酸盐在酸性条件下分解；还使一些与有机酸结合的金属离子(如Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+)发生络合或鳌合，减少了易与磷酸根结合的金属阳离子，使磷酸根离子被释放出来[21]。当土壤中有效磷增加后，侧根以及根毛可加快对磷元素的吸收，促进根系发育，增加紫花苜蓿的根瘤数，从而促进苜蓿株高和茎粗的生长[22]，这跟溶磷菌与根瘤菌之间的互作效应是密不可分的。马文彬等[13]研究表明，单菌株制备的接种剂可使箭筈豌豆地上生物量显著增加，与试验研究结果具有一定的相似性。

除了溶磷作用能外，还应注意到，研究采用的Gnyt1、Jm92、LSH11、Jm170等4株菌还有分泌IAA等植物激素的能力，其分泌的植物激素(如IAA)也能刺激苜蓿生长，李玉娥等[23]利用分泌IAA能力的菌株处理苜蓿后，第1茬各处理株高较对照分别增加19.0%～43.9%，茎增粗75.2%～80%；Molla M[24]研究表明PGPR合成的IAA能提高植物体内部α-淀粉酶的活性，将可溶性淀粉分解成糖类来促进植物发芽，而苜蓿的发芽部位主要是未成熟的种子、胚芽鞘、茎尖、根尖分生组织等生长旺盛的部位，同时这些部位也是植物体内产生IAA的主要组织和器官；本研究中苜蓿株高、茎粗的增加，可能是接种的PGPR菌株分泌的IAA提高了苜蓿幼苗活力，促进其生长发育。苜蓿幼苗形态发育将影响作物的生长及对营养的吸收，对苜蓿株高和茎粗有促进作用[4]。

3.2 菌株对苜蓿品质的影响

苜蓿营养品质是评价菌剂施用效果的重要指标。管鹏[7]研究发现使用单一PGPR菌肥与对照相比苜蓿CP含量增幅为6.69%～25.11%；韩华雯等[15]接种PGPR菌肥使苜蓿EE含量与对照相比减少1.31%～7.04%(第1茬)；Vessey[26]报道，PGPR菌肥通过一系列复杂的机制增加植物根际养分的有效性、产生嗜铁素、辅助其他主要共生关系等，使苜蓿的粗蛋白质更好的积累，同时粗纤维的生成受到抑制，提高了苜蓿品质。通过对紫花苜蓿接种不同PGPR菌剂后，苜蓿CP、EE的含量明显增加，ADF、NDF含量减少。说明PGPR菌肥通过一系列复杂的机制，能够促进CP、EE的合成代谢，抑制ADF和EDF的合成，在显著提高苜蓿干草产量的同时也能有效改善苜蓿干草的品质，最终实现高产、优质的双重目标。

试验发现不同PGPR菌剂改善紫花苜蓿品质的效果不同，这与不同菌株溶磷以及分泌植物激素能力不同有关，磷素的供给水平还可以影响紫花苜蓿生物固氮的效率，而磷素及氮素的含量与叶绿素含量存在极显著的正相关关系，叶绿素含量直接影响着植物的净光合速率和光合产物的形成[27]，从而影响植株中蛋白质和脂肪的含量。因此，当促生菌溶磷能力有差异时，其对宿主植物的固氮能力以及光合效率均会产生不同的影响。

4 结论

PGPR菌剂能够改善紫花苜蓿品质，促进生长，以菌株Gnyt1效果最佳，具有进一步开发利用的潜力，此次研究同时为西北干旱、半干旱区使用PGPR菌肥获得优质高产苜蓿提供了理论依据。