3种冷季型草坪草苗期对干旱胁迫的生理响应

宋娅丽，王 莎，王克勤，张 倩，马 志， 陈佳钰，李珠宇

(1.西南林业大学 生态与水土保持学院，云南 昆明 650224； 2.北京林业大学 水土保持学院，北京 100083)

干旱胁迫是限制草坪草生长的重要环境因子之一[1]。中国淡水资源严重缺乏、干旱面积广大，其中干旱、易干旱、半干旱和半湿润地区约占国土面积的52.5%[2]。由于人均水资源偏低，干旱胁迫不只发生在北方干旱半干旱地区，同样也会发生在年降水量较大的南方湿润半湿润地区，此地区由于雨量时空分布的不均经常发生季节性干旱[3]。随着全球性气候变暖，我国各区域平均降水量下降，且秋冬少雨、旱涝分明，各地旱情均有发生[4]。干旱缺水使草坪草地上部分变褐色，严重影响了其建坪质量、后期产量和效率[5]，还使草坪外部形态特征、植物光合呼吸速率、细胞质膜透性及细胞内的保护酶系统发生改变。用具有低需水型或抗旱型特征的草坪草来建植草坪，节水可达50%[6]。因此，掌握不同冷季型草坪草的抗旱机理，筛选抗旱性强的品种进行栽培、引种及选育已成为干旱地区草坪业发展亟待解决的课题。

黑麦草(Loliumperenne)、高羊茅(Festucaarundinacea)和早熟禾(Poapratensis)均为昆明地区广泛种植的3种多年生冷季型草坪草，多用于公园、庭院及小型绿地上建植的先锋草种，各自特征具有一定的差异。黑麦草种子萌发迅速，耐践踏，成坪和建植速度快[7-8]。高羊茅成坪后常绿、适应的土壤范围广，耐粗放管理[9-10]。早熟禾颜色光亮鲜绿，且绿期长，耐践踏，草质柔软、坪质优美、适用性广[11-12]。以往有关草坪草抗旱性的研究集中于抗旱性评价方法、不同草坪草种子萌发期耐旱能力的研究等方面[5,13-14]。但将3种冷季型草坪草作为研究对象，探讨和比较干旱胁迫对其生理生态影响的研究鲜有报道。因此，以昆明地区广泛使用的3种冷季型草坪草为供试材料，采用盆栽控水试验来研究不同持续时间干旱胁迫下，3种冷季型草坪草的草坪外观质量(TQ)、叶片萎蔫系数(LWS)、叶片相对含水量(RWC)、地上部分和根系生物量(Bio)、根冠比(RS)、叶片光合速率(Pn)、叶片暗呼吸速率(R)、脯氨酸含量(Pro)、细胞膜透性(RC)以及可溶性糖含量(Sol)等生理生态指标的动态变化，从生理角度分析和探索3种冷季型草坪草的抗旱响应机制，为进一步阐明草坪草抗旱机理提供理论基础，为草坪建植过程中抗旱草种的选择提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试验设计

供试材料由北京克劳沃公司提供，均为进口的多年生冷季型草坪草，品种分别为黑麦草(辉煌)、高羊茅(火凤凰2号)和早熟禾(雪狼)。

试验于2016年4月初在西南林业大学生态与水土保持学院温室大棚内进行。播种方式为盆栽方法，种子种植于装有多孔粘土的PVC管中(直径10 cm，深40 cm)培养，沙土比为1∶1。待种子发芽后每2 d浇一次水，每4 d用Hoagland营养液浇灌。在培养期间，每周修剪植株以控制平均高度在10 cm。播种试验在温室内进行，自然光照，不加温，材料的培养的处理参照文献[15]的方法并略作修改。

播种3个月后将植株转入能够控制环境因子的步入式恒温培养箱中生长。在恒温培养箱中培养两周，温度为21℃ /18℃(日/夜)，相对湿度为70%，光合有效辐射为12 h，660 μmol/(m2·s)。2周后进行干旱胁迫处理，处理4周。对照和干旱处理的温度均设置为20℃ /17℃(日/夜)，浇水量分别为100%水分蒸散量(ET)和50%水分蒸散量(ET)。不同草种的对照和处理各3个重复。植物培养在不同恒温培养箱中会由于不同的环境条件对植株产生一定的影响，因此，植株在培养期间随机放置，并一周换一次培养箱以减小和避免这种影响。每个星期将植株重新放在不同恒温培养箱中，其他条件包括70%的相对湿度、750 μmol/(m2·s)的光合有效辐射，以及12 h的光周期。

1.2 测定指标和方法

2016年7月中旬开始，每周分别在第0、7、14、21、28 d测定草坪外观质量(TQ)、叶片萎蔫系数(LWS)、选取长势好的叶片测定叶片相对含水量(RWC)、叶片光合速率(Pn)、叶片暗呼吸速率(R)和叶片相对电导率(RWC)。试验结束后测定地上部分和根系干重(Bio)、脯氨酸含量(Pro)和可溶性糖含量(Sol)。

草坪外观质量基于试验过程中草坪草地上部分均匀度、整齐度和颜色来进行评价，数值取值范围为1～9，1是长势差、完全枯萎和棕色的草坪，而9是长势好、水分充足和颜色鲜绿的草坪[16]。叶片萎蔫系数根据叶片颜色和萎蔫状况来进行评价，数值取值范围同样为1～9，1是枯黄和完全萎蔫的草坪，9是颜色鲜绿和水分状况好的草坪。叶片光合速率和暗呼吸速率均使用便携式红外线分析仪(LI6400,LI-COR Inc,USA)在6叶期的第二叶龄叶片上测定，暗呼吸速率测定前关闭红蓝光源，待闭合气室气体稳定约10 min后测定。生物量测定采用常规烘干法[17]；脯氨酸含量采用酸性茚三酮比色法测定[18]；可溶性糖含量采用蒽酮法测定[19]。

叶片相对含水量=RWC(%)=[(FW-DW)/(TW-DW)]×100

(1)

式中：FW为叶片初始鲜重，TW为泡水后肿胀的饱和叶片鲜重，DW为叶片干重。

首先将完全展开的叶片样品从植物上取下，立即称鲜重即为FW；然后将已称重的叶片用纸巾包好，并浸泡在装满蒸馏水的离心管中，在夜晚4℃下避光放置12 h，取出后用吸水纸吸取叶片表面水分后迅速称重即为TW。叶片DW则是称取TW后，将叶片放在87℃烘箱中烘72 h，烘干后取出称干重[20]。

相对电导率=Cinitial/Cmax×100%

(2)

式中：Cinitial为浸在去离子水中，常温下震荡24 h后用电导仪测定溶液的电导率；Cmax为放入沸水种20 min后，冷却至室温后的电导率[21-22]。

根冠比=根系干重/地上部分干重[23]

(3)

1.3 数据分析

采用Excel和SPSS 19.0对数据进行处理和统计分析，One-Way ANOVA进行单因素方差分析，并用Duncan进行多重比较。

耐受性评价方法采用隶属函数法[24]，评价时3个品种的各指标均使用胁迫第28 d时的数据。

(1)各指标的隶属函数值

当指标与植物耐受性呈正相关时：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

当指标与植物耐受性呈负相关时：

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)平均隶属值

X=∑Xi/n

式中：U(Xi)为各指标的隶属值，U(Xi)越大耐受性越强；Xi为某一指标的测定值；Xmax和Xmin分别为某一指标的最大值和最小值；X为平均隶属值。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对3种冷季型草坪草外观质量和叶片萎蔫系数

参照NTEP 9 分制评价法对干旱胁迫下供试草坪

草外观质量(TQ)和叶片萎蔫系数(LWC)进行评价，3种冷季型草坪草黑麦草(a)、高羊茅(b)、早熟禾(c)的TQ和LWC总体变化一致，在干旱胁迫下均随着时间的持续逐渐降低(图1，2)。早期干旱胁迫下，3种草坪草的TQ变化和LWC下降与对照相比较为平缓，在21 d时下降显著。早熟禾TQ和LWC在28 d下降到4以下。早熟禾和黑麦草较高羊茅下降更为显著(P<0.05)，3种冷季型草坪草TQ和LWC评分值从高到低的顺序为高羊茅>黑麦草>早熟禾。

图1 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)的草坪外观质量Fig.1 Effect of drought stress on turf quality of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

图2 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)叶片的萎蔫系数Fig.2 Effect of drought stress on leaf wilting score of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

2.2 干旱胁迫对3种冷季型草坪草叶片相对含水量

植株正常的生理代谢需要一定的水分，当浇水量不足导致土壤水分供应不足时，叶片相对含水量降低，致使各种代谢紊乱。随着干旱胁迫天数的增加，3种草坪草的叶片相对含水量(RWC)均显著下降，且在28 d时最低(图3)。与正常浇水量相比，3种冷季型草坪草在干旱胁迫处理初期RWC下降不明显。在21 d时与对照相比差异显著(P<0.05)，黑麦草、高羊茅和早熟禾的RWC比对照分别下降了44%，17%和67%。高羊茅的下降幅度小于黑麦草、早熟禾，RWC减小程度较小则抗旱性较强，表明其具有较强的叶片保水能力。

2.3 干旱胁迫对3种冷季型草坪草生物量和根冠比

干旱胁迫下3种草坪草的地上部分和根系生物量(Bio)均显著降低(P<0.05)，但下降幅度不同。与对照相比，黑麦草、高羊茅和早熟禾的地上部分Bio在干旱胁迫下分别降低了8%，18%和39%，根系Bio分别降低了12%，28%和45%，说明干旱胁迫对根系Bio的影响大于对地上部分的影响(表1)。干旱胁迫下，3种草坪草的平均根冠比(RS)与对照相比差异显著(P<0.05)。干旱胁迫下3种草坪草中高羊茅的RS最低，黑麦草次之，早熟禾最高。

图3 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)叶片的相对含水量Fig.3 Effect of drought stress on relative water content of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

测定指标/品种黑麦草对照干旱高羊茅对照干旱早熟禾对照干旱地上部分生物量/g3.998 1±0.087 0a3.676 1±0.035 4b5.117 5±0.330 2a4.217 3±0.426 2b2.058 5±0.042 4a1.255 3±0.076 2b地下部分干重/g4.355 1±0.291 0a3.841 8±0.036 6b6.184 8±0.560 8a4.452 1±0.484 1b2.143 9±0.094 5a1.188 6±0.234 0b根冠比1.158 8±0.068 6a1.219 5±0.176 8a1.222 2±0.473 1a1.058 5±0.614 5b0.976 4±0.077 9a2.067 6±0.187 9b

注：同行不同小写字母表示同一品种草坪草下干旱胁迫与对照相比差异显著(P<0.05)

2.4 干旱胁迫对3种冷季型草坪草叶片光合速率和暗呼吸速率的影响

干旱胁迫显著降低了3种草坪草的叶片光合速率(Pn)(P<0.05)，且在28 d时最低。与对照相比，黑麦草、高羊茅和早熟禾在干旱胁迫下第7 d分别降低了28%，13%和30%，第28 d分别降低了68%，52%和80%。3种草在28 d的下降幅度中，早熟禾最高，其次，黑麦草和高羊茅。与Pn相反，干旱胁迫显著提高了3种草坪草的叶片暗呼吸速率(R)(P<0.05)，且在28 d时最高。与对照相比，黑麦草、高羊茅和早熟禾在干旱胁迫下第7 d分别升高了14%，4%和42%，第28 d分别升高了40%，23%和83%。3种草在28 d的升高幅度中，早熟禾最高，其次为黑麦草和高羊茅(图4，5)。

图4 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)叶片的光合速率Fig.4 Effect of drought stress on photosynthetic rate of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

2.5 干旱胁迫对3种冷季型草坪草脯氨酸和电导率的影响

植株在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但植物中游离脯氨酸会在干旱、高温、低温或盐碱等逆境胁迫下大量积累，以进行渗透调节，其积累指数与植物的抗逆性有关[25]。干旱胁迫下的黑麦草、高羊茅和早熟禾的脯氨酸含量(Pro)显著高于对照(图6)，叶片Pro分别在干旱胁迫下增加了105%，192%和10%，根系Pro分别上升了141%，449%和9%，说明3种草坪草均有一定的抗旱性。高羊茅在干旱胁迫下大量积累脯氨酸，叶片Pro分别比黑麦草、早熟禾高出102%和399%、根系Pro分别高出109%和679%，差异极显著(P<0.01)。

图5 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)叶片的暗呼吸速率Fig.5 Effect of drought stress on dark respiration rate of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

图6 干旱胁迫处理下3种冷季型草坪草叶片和 根系的脯氨酸含量Fig.6 Effect of drought stress on proline content in leaf and root of 3 cool-season turfgrasses

由于植株细胞膜是控制小分子物质进出细胞的屏障，如果细胞膜受损就会造成细胞液外渗，外渗液电导率增大，会导致质膜损伤程度增大，电导率增加[26-27]。干旱胁迫与对照相比明显增加了3种冷季型草坪草的叶片相对电导率(RC)(图7)。干旱胁迫下黑麦草和高羊茅的叶片RC均是在胁迫初期直至胁迫14 d无显著变化，21～28 d时显著上升(P<0.05)；而早熟禾的叶片RC随着胁迫时间的持续变化不明显。在28 d，干旱胁迫下黑麦草、高羊茅、早熟禾的RC较对照分别增加了4.7%，5.3%和3.4%。

图7 干旱胁迫处理下黑麦草(a)，高羊茅(b)和早熟禾(c)叶片的相对电导率Fig.7 Effect of drought stress on relative conductivity rate of ryegrass (a),tall fescue (b) and Kentucky bluegrass (c)

2.6 干旱胁迫对3种冷季型草坪草可溶性糖的含量

可溶性糖是植物体内的重要渗透调节物质之一，土壤含水量减少导致可溶性糖含量增加，有利于维持植物体细胞膨压，抑制由于胞内水分过度损失而造成的被动脱水[28]。黑麦草、高羊茅和早熟禾的可溶性糖含量(Sol)显著高于对照(图8)，叶片Sol分别在干旱胁迫下增加了27%，53%和51%，根系Sol分别上升了46%，79%和68%。在干旱胁迫下，3种冷季型草坪草Sol在根系上的积累高于地上部分，高羊茅叶片、根系的Sol上升幅度高于黑麦草和早熟禾，差异极显著(P<0.01)。说明高羊茅在干旱胁迫下大量积累可溶性糖，适应水分胁迫逆境能力较强。

图8 干旱胁迫处理下黑麦草、高羊茅和 早熟禾的可溶性糖含量Fig.8 Effect of drought stress on soluble sugar content of ryegrass,tall fescue and Kentucky bluegrass

2.7 干旱胁迫对3种冷季型草坪草的耐受性评价

利用模糊数学的隶属函数法对3种冷季型草坪草的9项生理生态指标进行耐受性综合评价，用每种草坪草各项指标隶属度的平均值作为不同草坪草抗逆性综合鉴定标准，该值越大抗逆性则越强。结果表明，黑麦草、高羊茅和早熟禾在干旱胁迫下的隶属函数平均值分别为0.425，0.667和0.333，表明3种草坪草抗旱能力顺序为高羊茅>黑麦草>早熟禾。

表2 3种冷季型草坪草对干旱胁迫的耐受 性综合评价

3 讨论

以黑麦草、高羊茅和早熟禾为试验材料，通过测定3种冷季型草坪草的外观质量、叶片萎蔫系数、植物叶片含水量、根冠比、叶片光合速率、叶片暗呼吸速率、质膜透性、脯氨酸含量和可溶性糖含量9项指标对3种冷季型草坪草的抗旱性进行了综合评价，防止了单一指标的局限性。随着干旱胁迫时间的延长，3种冷季型草坪草的草坪外观质量、叶片萎蔫系数、叶片相对含水量、生物量、叶片光合速率呈逐渐下降的趋势；叶片暗呼吸速率、脯氨酸含量、电导率和可溶性糖含量均呈上升趋势。

在干旱处理后期，3种草坪草中早熟禾的草坪外观质量和萎蔫系数最低，其次为黑麦草和高羊茅。水分胁迫条件下，植物叶片相对含水量变化趋势与叶片萎蔫系数相同，叶片含水量越小，草坪草萎蔫系数越小，植物所受干旱伤害越大，其抗旱能力越弱[29]。试验中早熟禾在干旱胁迫下的下降幅度最大，表明其抗旱性最弱，相反黑麦草次之，高羊茅抗旱性则最强。干旱胁迫发生第14 d，黑麦草和早熟禾的叶片相对含水量反而高于对照，说明植物在干旱胁迫条件初期，本身具有一种适应性调节机制，这种调节机制通过各种代谢反应来尽可能避免由于干旱胁迫引起的伤害，从而最大限度地提高抗旱性能。但当干旱胁迫使植株体内水分亏缺达到一定程度的情况下，会导致细胞结构的破坏，从而减小生物量。试验中早熟禾和黑麦草地上部分和根系生物量小于高羊茅。

在干旱胁迫下，由于浇水量低于水分蒸散量，3种冷季型草坪草的碳固定发生变化，土壤水分有效性减小，使植株在干旱条件下非常敏感，这在其他研究中也有报道[30-31]。干旱胁迫降低了3种草坪草地上部分和根系生物量，同时也降低了叶片光合速率，而暗呼吸速率随着胁迫时间的持续而不断增加。呼吸作用的增加与光合作用的减小具有较高的相关性，这是由于植物生理过程中酶作用物的有效性是通过自养和异养呼吸的植物分泌物来控制的[32]。在干旱胁迫下，3种冷季型草坪草在28 d叶片光合速率平均降低了66%，叶片暗呼吸速率提高了49%。干旱胁迫会抑制冷季型草坪草的光合作用，提高呼吸作用，但较为耐旱的草种比不耐旱的草种具有更高的光合速率和更低的暗呼吸速率。随着干旱胁迫时间的持续，干物质积累差异越来越大，植株停止生长，这些生理变化均是植株通过自身调节以增强对极端干旱的适应。

4 结论

质膜是细胞与环境之间的界面与屏障，干旱胁迫下的植物原生质膜的组成和结构发生明显变化，导致细胞内含物质大量外渗[33]。试验中随着盐胁迫时间的延长，相对电导率呈上升趋势，盐胁迫前期上升幅度较缓，后期上升幅度较大。脯氨酸对草坪草抗旱性具有渗透调节作用，同时也是在干旱胁迫下的一种保护性、适应性反映。草坪草脯氨酸含量随干旱胁迫时间的增加迅速升高，抗旱性强的植物体内会积累较多脯氨酸[13,27]。脯氨酸的积累量与品种的抗旱能力之间呈正相关，试验中高羊茅在干旱胁迫过程中保持高的脯氨酸积累量，表明其抗旱性相对较强；黑麦草和高羊茅脯氨酸积累量虽低于高羊茅，但始终高于对照，说明其具有一定的抗旱性。说明在干旱胁迫下，脯氨酸对于植物保水、提高抗旱能力中起到重要作用。可溶性糖含量是草坪草适应干旱环境的一种保护性调节机制[34]，早熟禾在干旱胁迫下可溶性糖含量相对于其他2种草坪草较低，但增加百分率较高，说明早熟禾的可溶性糖调节作用随着干旱胁迫时间的持续逐渐增强，这有利于植株在干旱环境中维持正常的水分代谢。

干旱胁迫处理第28 d，与对照相比，高羊茅草坪草外观质量、叶片萎蔫系数、叶片相对含水量、地上部分和根系生物量、叶片光合速率降低的比例显著低于黑麦草和早熟禾，叶片暗呼吸速率、脯氨酸、质膜透性、可溶性糖含量增加的倍数显著高于黑麦草和早熟禾，通过隶属函数法综合分析各种草坪草的耐旱能力，得出3种冷季型草坪草抗干旱能力由强到弱依次为高羊茅>黑麦草>早熟禾。