意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物对大鼠缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤作用的研究

马桂芝， 滕 亮， 盖敏涛， 万琪臻， 代己果

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐 830011； 2第一附属医院药学部； 3第一附属医院心脏中心， 乌鲁木齐 830054)

冠心病亦称缺血性心脏病，目前已成为对人类健康和生命威胁最大的疾病之一，我国的缺血性心脏病发病率和死亡率也呈逐年上升趋势，缺血性心脏病的预防和治疗也得到了国内外学者很大关注[1-3]。意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz．)为紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物[4]，具有生湿生热、润燥消炎、止咳平喘等功效，主要用于高血压、肺炎及结核疾病、寒性咳嗽、感冒、气喘等疾病的治疗[5]。本课题组前期研究结果表明意大利牛舌草乙醇提取物对缺氧/复氧心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用[6]，为进一步确定意大利牛舌草抗心肌细胞氧化应激损伤的物质基础，本实验采用心肌细胞缺氧/复氧模型，通过测定心肌细胞存活率、氧化应激指标乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量，探究意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用，为阐明意大利牛舌草抗心肌细胞氧化应激损伤物质基础及后续开发研究奠定试验基础，现报道如下。

1 材料和方法

1.1药材意大利牛舌草2014年6月购自新疆伊鼎辉煌生物科技有限公司，产地为巴基斯坦，经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetz)的干燥地上部分。

1.2实验动物出生1～3 d的SD大鼠，由新疆医科大学动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(新) 2011-0004。

1.3仪器SLI-400型孵育箱(日本东京理化器械制造厂)，SHZ-B型恒温水浴摇床(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)，DK-8D型恒温水浴锅(上海-恒科技有限公司)，SX-500型高压灭菌锅(日本Tomy Digital Biology公司)，Multiskan GO型酶标仪(美国Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)，HeraeusMultifuge X3R型离心机(中国香港Heal Force公司)，HF90型培养箱(中国香港Heal Force公司)，ZHJH-C1214B型双人双面超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)。

1.4试剂高糖、低糖DMEM培养液(美国HyClone公司，批号AAJ207748)，胎牛血清(美国HyClone公司，批号GYK0119)，青链霉素(美国HyClone公司，批号J160007)，谷氨酰胺(美国Sigma公司，批号RNBC5692)，胶原酶(美国Gibco公司，批号1133838)，0.1%胰酶(美国Worthington公司，批号45D15719)，0.25%胰酶(美国HyClone公司，批号J140051)，D-Hanhs液、非必需氨基酸(美国Sigma公司，批号RNBD6137)，总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20160511)，丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20160429)，乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20160509)。

1.5方法

1.5.1 意大利牛舌草不同极性萃取物的制备 取意大利牛舌草100.0 g，加入800 mL 60%乙醇进行回流提取，提取3次，每次2 h，将提取液合并，减压浓缩为浸膏，经冷冻干燥得意大利牛舌草乙醇提取物。取意大利牛舌草乙醇提取物，以水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压浓缩，冷冻干燥，分别得到意大利牛舌草石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物。

1.5.2 心肌细胞分离与培养 新生SD乳鼠心脏置于D-Hanks液中，排出残留血液，剪取心尖1/3处，将心室剪为4～8瓣。放入提前配好并预冷的0.1%胰酶溶液中，置于4℃ 50次/min水浴摇床上，消化过夜。第2天用等体积的完全培养液中和胰酶，置于37℃水浴摇床以80次/min速度震荡7～10 min后吸弃上清液，加入Ⅱ型胶原酶，置于37℃水浴摇床以80次/min速度震荡7～10 min，加入等体积的完全培养液至消化完的上清液中终止消化，将终止消化的上清液置于二氧化碳培养箱中，重复4～5次，直至组织完全消化，所得消化液 1 500 r/min离心5 min，以37℃完全培养液重悬得到细胞悬液。将细胞悬液接种于培养基中，并置于二氧化碳培养箱中差速贴壁2次(50、40 min)。收集并计录细胞数，用预热的完全培养液调整细胞浓度，含10%胎牛血清的DMEM培养基培养心肌细胞，置于常规培养箱(5%CO2，21%O2)培养，静置培养48 h后换液。

1.5.3 细胞缺氧/复氧模型(H/R)的建立 取待处理细胞接种于无血清低糖培养基，放入缺氧密闭(5%CO2，95%N2；37℃)环境内孵育6 h，再更换为正常培养基，置于常规培养箱中培养3 h。

1.5.4 试验分组 试验分为12组，正常对照组，缺氧/复氧模型组，阳性对照(葛根素)组，处理组包括：低剂量乙酸乙酯萃取物处理组(缺氧/复氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、中剂量乙酸乙酯萃取物处理组(缺氧/复氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、高剂量乙酸乙酯萃取物处理组(缺氧/复氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物)、低剂量正丁醇萃取物处理组(缺氧/复氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、中剂量正丁醇萃取物处理组(缺氧/复氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、高剂量正丁醇萃取物处理组(缺氧/复氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草正丁醇萃取物)、低剂量水萃取物处理组(缺氧/复氧+0.005 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)、中剂量水萃取物处理组(缺氧/复氧+0.01 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)、高剂量水萃取物处理组(缺氧/复氧+0.1 μg/mL意大利牛舌草水萃取物)。

1.5.5 MTT 比色法测定心肌细胞存活率 将心肌细胞接种于96孔板中，不同浓度梯度(0.01、0.10、1.00、10.00、100.00、1 000.00 μg/mL)意大利牛舌草极性不同溶剂萃取物(石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物)干预H/R心肌细胞，作用不同作用时间(1、6、12、24、48 h)，按“1.5.3”项下方法进行缺氧/复氧处理后，每孔加入 MTT 溶液20 μL(5 mg/mL) ，37℃孵育4 h，弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，摇床缓慢振荡 10 min，使结晶物完全溶解，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算细胞存活率，确定不同浓度意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物适宜的作用浓度与作用时间。

1.5.6 LDH、MDA、SOD表达水平的测定 心肌细胞常规培养24 h后，进行相应处理后收集各组细胞培养上清液，按试剂盒操作方法测定 LDH。心肌细胞进行相应处理后分别测定 SOD、MDA，实验步骤按试剂盒说明操作。

2 结果

2.1不同浓度意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物对心肌细胞存活率的影响

2.1.1 不同浓度意大利牛舌草石油醚萃取物对心肌细胞存活率的影响 将浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草石油醚萃取物分别给予心肌细胞，预处理24 h后进行缺氧/复氧，用酶标仪490 nm处测定吸光度，计算其存活率，浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL时，其细胞存活率分别为：(34.84±11.72)%、(34.11±6.87)%、(30.74±9.90)%、(28.57±6.76)%、(39.95±7.53)%、(83.79±7.18)%，与模型组比较，意大利牛舌草石油醚萃取物1 000μg/mL剂量组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 不同浓度意大利牛舌草石油醚萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.1.2 不同浓度意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 将浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物分别给予心肌细胞，预处理24 h后进行缺氧/复氧，酶标仪490 nm处测定吸光度，计算其存活率，浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL时，其细胞存活率分别为：(84.92±5.58)%、(84.57±5.38)%、(74.37±4.05)%、(74.93±3.23)%、74.87±4.25)%、(64.57±8.42)%。与模型组比较，意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物0.01～100.00 μg/mL剂量组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 不同浓度意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.1.3 不同浓度意大利牛舌草正丁醇萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 将浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草正丁醇萃取物分别给予心肌细胞，预处理24 h后进行缺氧/复氧，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算其存活率，浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL时，其细胞存活率分别为：(82.31±6.10)%、(78.55±8.37)%、(81.94±7.68)%、(86.82±10.24)%、(85.06±6.00)%、(93.11±23.05)%。与模型组比较，意大利牛舌草正丁醇萃取物0.01～100.00 μg/mL剂量组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见图3。

图3 不同浓度意大利牛舌草正丁醇萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.1.4 不同浓度意大利牛舌草水萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率 将浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL的意大利牛舌草水萃取物分别给予心肌细胞，预处理24 h后进行缺氧/复氧，酶标仪490 nm处测定吸光度，计算其存活率，浓度为0.01、0.10、1.00、10.00、100.00和1 000.00 μg/mL时，其细胞存活率分别为：(79.37±12.18)%、(76.11±9.80)%、(81.90±9.00)%、(80.09±7.35)%、(85.24±7.38)%、(93.92±5.71)%，与模型组比较，意大利牛舌草水萃取物0.01～1 000.00 μg/mL剂量组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，见图4。

图4 不同浓度意大利牛舌草水萃取物对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.2意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物不同预处理时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响

2.2.1 意大利牛舌草石油醚萃取物不同预处理时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 给予细胞意大利牛舌草石油醚萃取物浓度为1 000 μg/mL，不同时间预处理(1、6、12、24、48 h)后，进行缺氧/复氧处理，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算其存活率，细胞存活率分别为：(22.48±7.74)%、(31.03±9.18)%、(47.62±9.69)%、(54.99±15.16)%、(61.77±9.87)%。与模型组比较，意大利牛舌草石油醚萃取物48 h组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图5。

图5 意大利牛舌草石油醚萃取物不同作用时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.2.2 意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物不同预处理时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 给予细胞0.01 μg/mL的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物，不同时间预处理(1、6、12、24、48 h)后，进行缺氧/复氧处理，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算其存活率，细胞存活率分别为：(80.77±16.91)%、83.73±7.02)%、(89.51±4.06)%、(81.11±11.08)%、(98.12±1.42)%。与模型组比较，意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物1、6、12、24、48 h组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图6。

图6 意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物不同作用时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.2.3 意大利牛舌草正丁醇萃取物不同预处理时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 给予细胞浓度为0.01 μg/mL的意大利牛舌草正丁醇萃取物，不同时间预处理(1、6、12、24、48 h)后，进行缺氧/复氧处理，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算其存活率，细胞存活率分别为：(72.19±12.46)%、(71.64±10.23)%、(73.11±10.96)%、(75.87±10.20)%、(63.72±11.06)%。与模型组比较，意大利牛舌草正丁醇萃取物1、6、12、24 h组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图7。

2.2.4 意大利牛舌草水萃取物不同预处理时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响 给予细胞浓度为0.01 μg/mL的意大利牛舌草水萃取物，不同时间预处理(1、6、12、24、48 h)后，进行缺氧/复氧处理，用酶标仪测定490 nm处吸光度，计算其存活率，细胞存活率分别为：(70.90±20.20)%、(72.03±15.13)%、(68.65±8.75)、(84.27±10.53)%、(82.34±9.51)%。与模型组比较，意大利牛舌草正丁醇萃取物24、48 h组心肌细胞存活率升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图8。

图7 意大利牛舌草正丁醇萃取物不同作用时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

图8 意大利牛舌草水萃取物不同作用时间对缺氧/复氧心肌细胞存活率的影响(n=10)

2.3意大利牛舌草不同极性溶剂萃取物对LDH释放量、SOD活力及MDA生成量的影响与对照组比较，模型组心肌细胞内LDH、MDA含量增高、SOD含量降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，高剂量的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物组LDH、MDA含量降低，SOD含量增高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 意大利牛舌草不同极性萃取物对心肌细胞氧化应激的影响

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与葛根素组比较，&P<0.05。

3 讨论

体外抗心急缺血研究方法目前主要为应用心肌细胞缺氧复氧模型评价受试物对模型细胞的存活率的影响，其中物理性缺氧模型在氧浓度5%～8%条件下即可形成缺氧环境，造模难度小，得到的模型稳定，同时可以排除神经、体液等复杂因素的影响，是常用的氧化应激的模型方法[7-8]。心肌细胞缺氧及缺糖，能量耗竭，培养基中乳酸盐积聚，引起心肌细胞膜结构及功能损害，细胞膜通透性增高，导致胞浆酶(LDH、MDA)释放[9]，SOD作为一种抗氧化酶，可以抵抗机体受氧化损伤，其活性高低也可反映机体抗体抗氧化能力，在机体抗氧化应激反应中具有重要作用[10]。本实验研究表明，高剂量的意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物组可明显降低由缺氧/复氧损伤引起的心肌损伤标志物LDH、MDA含量升高，并提高了抗氧化应激SOD水平，其中乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物因较小的有效剂量与较短的干预时间显示了对损伤心肌细胞较强的保护作用，其机制可能与清除氧化应激产物MDA，增加细胞内抗氧化酶SOD活性有关，具体的作用机制还需进一步研究。