长链非编码RNA MEG3在人胶质瘤细胞中的表达及作用研究

范宁宁 耿敬姝

胶质瘤的发病机制多变且病因复杂，为寻找胶质瘤的有效治疗方法带来了极大的阻碍[1]。MicroRNA-21(miR-21)被证实在胶质瘤中高表达，并通过多个靶点促进胶质瘤的迅速发展和恶化[2-3]，意味着miR-21可以作为治疗胶质瘤的关键靶点。长链非编码RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)不仅可以作为多种肿瘤的诊断标志，还能参与和调控肿瘤的发生，然而目前对于LncRNA在胶质瘤发生中的作用仍知之甚少[4]。最近研究显示，与正常脑组织相比，LncRNA MEG3在胶质瘤中的表达明显降低，并且与胶质瘤患者的预后显著相关[1]，提示MEG3很可能与胶质瘤的恶性发展相关。然而，这其中深入的机制还需要进一步探究。

因此，本研究利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)观察MEG3和miR-21体外培养的胶质瘤细胞内的表达情况，并且利用细胞转染等方法探究了过表达MEG3与miR-21对人胶质瘤细胞的活力与凋亡情况的影响。

1 材料与方法1.1 细胞培养

正常人胶质细胞系(NHAs)和人胶质瘤细胞系(U87)在37℃和5% CO2的培养箱和完全培养基中培养。完全培养基包含90% DMEM、10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mM以及100 U/mL的青链霉素。

1.2 RT-qPCR

细胞的总RNA利用Trizol试剂法提取。利用纳米分光光度计ND-100检测RNA在260～280 nm处吸光度值并计算浓度。实验中采用逆转录试剂盒ReverTra Ace RT-qPCR RT kit，根据说明书合成cDNA；RT-qPCR采用试剂盒THUNDERBIRD SYBR RT-qPCR Mix进行扩增，qPCR引物见表1。每个待测样品设置3个平行复孔，MEG3以GAPDH作为内参照，miR-21以U6作为内参照进行相对标准化。RT-qPCR在定量PCR反应仪ABI 7500 fast Real-Time PCR system上进行。三次独立实验后得到的数据运用2-ΔΔCt的方法进行分析。

表1 人LncRNA、mRNA和microRNA的PCR引物序列

1.3 U87细胞转染

生物合成过表达质粒pEGFP-MEG3、阴性对照质粒pEGFP-N1、miR-21mimic以及阴性microRNA(miR-NC)。U87细胞在6孔板上培养24 h后开始转染。采用转染试剂Lipofectamine 2000并依照试剂说明书的步骤转染U87细胞。

转染细胞分组：(1)Control组：正常对照，不做任何转染处理；(2)NC组：转染pEGFP-N1质粒，作为阴性对照；(3)MEG3组：单纯转染pEGFP-MEG3质粒；(4)MEG3+miR-NC组：共转染pEGFP-MEG3质粒和miR-NC；(5)MEG3+miR-21组：共转染pEGFP-MEG3质粒和miR-21；

首先将细胞在无血清无双抗的DMEM培养液中培养6 h。然后再配制转染体系：在适量的Opti-MEM培养基中稀释寡聚物或质粒，用无菌枪头轻轻混匀；同时将lipo-2000 Transfection Reagent与适量的Opti-MEM轻轻混匀后，在室温下放置5 min。最后将稀释的寡聚物或质粒和稀释的lipo-2000 Transfection Reagent混合，在室温下放置15 min，使其形成稳定的复合物后，将复合物加入到培养板中，轻轻摇动培养板将其充分混合。在37℃、5% CO2培养箱中孵育8 h后，换为完全培养液继续培养48 h后进行后续处理。

1.4 CCK-8试验检测细胞活力

10 μL CCK-8试剂被加入到100 μL DMEM中混匀后，替换96孔板中待测细胞、对照细胞和空白对照孔的原培养液，空白对照孔为无培养细胞孔。在37℃ 5%CO2培养箱中继续培养细胞和空白对照2 h后，在酶标仪下检测450 nm下的OD值。被检测细胞的相对活力为：被检测细胞平均OD值-空白对照孔OD值/对照细胞平均OD值-空白对照孔OD值×100%。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡

细胞以1×104个/孔接种于24孔板中。待孵育结束后，弃去培养液，每孔分别加入200 μL新鲜配制的4%多聚甲醛，室温孵育30 min。弃去固定液，PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min。每孔加入200 μL 3%过氧化氢(甲醇配制)，室温10 min。待封闭结束后，PBS缓冲液冲洗3次，每次10 min。然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100柠檬酸钠溶液，4℃孵育3 min。再次重复前面冲洗过程后，弃去PBS缓冲液，每孔加入50 μL TUNEL反应混合液，37℃避光孵育1 h。PBS缓冲液冲洗3次后，加入200 μL DAPI溶液，37℃孵育15 min。PBS缓冲液冲洗3次后，荧光显微镜下观察并拍照。TUNEL染色液将细胞染成绿色，DAPI染色液将细胞染成蓝色。

1.6 Western blot检测

按照蛋白分子量要求，采用10% SDS-PAGE凝胶。蛋白按照计算体积上样后，首先在70 V电压下电泳30 min，然后在110 V下电泳至胶底部。电泳停止后，凝胶被取下，进行恒流300 mA冰浴转膜。转膜结束后，在滤过的5%脱脂牛奶室温摇床上封闭2 h。膜在蛋白一抗中4℃孵育过夜，蛋白一抗包括Pro-caspase-3(1∶1 000稀释)、Cleaved caspase-3(1∶1 000稀释)、Bcl-2(1∶500稀释)、Bax(1∶500稀释)和GAPDH(1∶1 000稀释)。TBST洗涤三次后，在荧光山羊抗兔二抗(1∶10 000稀释)中室温避光孵育1 h。膜在TBST室温摇床洗涤三次后，在Odyssey红外成像仪下检测和分析目的蛋白条带印迹灰度值情况。

1.7 统计分析

数据采用Graphpad Prism 5.0软件分析，数据以均数±标准差的形式表示。两组间比较采用t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 U87细胞系与NHAs细胞系MEG3和miR-21的表达

RT-qPCR结果显示U87中MEG3的相对表达水平为0.26±0.04，与NHAs(1.00±0.26)相比明显降低且差异有统计学意义(P<0.05)(图1A)。同时U87中miR-21的表达水平(2.65±0.31)明显高于NHAs(1.00±0.45)，差异有统计学意义(P<0.05)(图1B)。

图1 胶质瘤细胞内MEG3与miR-21的相对含量Figure 1 Relative expression levels of MEG3 and miR-21 in glioma cellsNote：A.The results of RT-qPCR showed that the expression of MEG3 in U87 cells was decreased when compared to NHAs(*P<0.05 vs. NHAs，n=6)；B.The results of RT-qPCR showed that the level of miR-21 expression in U87 cells was higher than that in NHAs(*P<0.05 vs. NHAs，n=6).

2.2 过表达MEG3对人胶质瘤细胞系中miR-21的表达影响

与NC组相比，MEG3组MEG3的表达量升高7.87±0.88倍(P<0.001)，说明MEG3过表达成功(图2A)。在此基础上与NC组相比，MEG3组miR-21的表达量降低0.34±0.05倍(P<0.05)(图2B)，说明在胶质瘤细胞中过表达MEG3可明显下调miR-21的水平。

图2 高表达MEG3下调胶质瘤细胞miR-21Figure 2 Glioma cells with overexpression of MEG3 downregulated the expression of miR-21Note：A.The results of RT-qPCR verified the successful overexpression of MEG3 in glioma cells(***P<0.001 vs. NC，n=6)；B.The results of RT-qPCR showed that overexpression of MEG3 downregulated the expression of miR-21(*P<0.05 vs. NC，n=6).

2.3 MiR-21逆转MEG3对胶质瘤细胞活力和凋亡的影响

CCK-8实验结果显示MEG3组与NC组相比细胞活力明显降低(P<0.05)(图3A)，提示过表达MEG3抑制胶质瘤细胞活力。然而，MEG3+miR-21组与MEG3+miR-NC组相比，U87细胞活力明显增加(P<0.01)，表明miR-21能逆转MEG3对U87细胞活力的抑制作用。进一步与NC组相比，MEG3组TUNEL阳性细胞数明显增加，而过表达MEG3+miR-21后，U87细胞凋亡数目较MEG3+miR-NC组明显减少(图3B)。以上结果说明miR-21能够逆转MEG3对人胶质瘤细胞活力的抑制和对凋亡的促进。

图3 miR-21逆转MEG3对胶质瘤细胞活力和凋亡的影响Figure 3 Effects of miR-21 on cell viability and apoptosis in human glioma cells with overexpression of MEG3Note：A.The cellular viability of U87 cells was measured by CCK-8 assay(*P<0.05 vs. NC，n=6；##P<0.01 vs. pEGFP-N1-MEG3+miR-NC)；B.The apoptosis of U87 cells was detected by TUNEL assay.

2.4 MiR-21逆转MEG3对胶质瘤细胞Bcl-2/Bax下调和Cleaved caspase-3上调

MEG3组Cleaved caspase-3/Pro-caspase-3的水平较NC组明显升高(P<0.05)，而Bcl-2/Bax明显降低(P<0.01)。然而，MEG3+miR-21组Cleaved caspase-3/Pro-caspase-3的水平较MEG3+miR-NC组明显降低(P<0.05)，而Bcl-2/Bax明显升高(P<0.01)(图4)。以上结果证明，miR-21能够逆转MEG3对人胶质瘤细胞Bcl-2/Bax的下调和Cleaved caspase-3的上调，从而削弱MEG3对人胶质瘤细胞的促凋亡作用。

图4 miR-21减弱MEG3对凋亡相关蛋白的影响作用Figure 4 miR-21 attenuated the effects of MEG3 on apoptosis related proteins in U87 cellsNote：The expression of cleaved caspase-3/pro-caspase-3 and Bcl-2/Bax ratio was examined in U87 cells by Western blot(* P<0.05 and ** P<0.01 vs. NC；# P<0.05 and ## P<0.01 vs. pEGFP-N1-MEG3+miR-NC，n=6).

3 讨论

本研究证明人胶质瘤细胞系U87中的MEG3的表达明显低于正常人胶质细胞系NHAs，相反miR-21在U87中的表达量却明显高于NHAs。过表达MEG3能够明显降低U87的miR-21表达，抑制U87的活力，降低Bcl-2/Bax水平，提高Cleaved caspase-3含量，促进凋亡；相反，共过表达MEG3和miR-21明显增加U87的活力，提高Bcl-2/Bax的水平，降低Cleaved caspase-3的含量，抑制凋亡。这些结果提示我们MEG3不仅是抵抗胶质瘤的LncRNA，还为我们提供了将MEG3研发成为治疗胶质瘤药物的重要依据。

LncRNA可以通过“分子海绵”吸附作用调节microRNA从而调控细胞活动[5]。如果LncRNA表达异常，会导致其调控的microRNA的表达紊乱，从而导致癌症的发生发展。Xiao等发现胶质瘤中LncRNA TP73-AS1异常升高而miR-124异常降低，从而导致胶质瘤的增殖[6]。Zhao等发现LncRNA GAS5在胶质瘤细胞中低表达而miR-222高表达，从而导致胶质瘤增殖和迁移[7]。研究表明MEG3的低表达抑制了p53的激活从而促进了垂体瘤的生长[8]。而MEG3的低表达也被预测与脑膜瘤的恶性发展相关[9]。此外，MEG3的低表达减少了β-连环蛋白的降解从而能够促进肝癌的发展[10]。本研究发现MEG3的表达在胶质瘤细胞中明显下降而miR-21明显升高。这也支持了之前的研究结果，即MEG3在胶质瘤中的表达明显降低[1]。已有研究表明MEG3能结合并调控miR-21在细胞内的水平和功能[11]。而本研究发现在胶质瘤细胞中过表达MEG3可使miR-21明显下降。因此，胶质瘤中MEG3的异常降低应是miR-21异常升高的原因，从而参与了胶质瘤的发展。

MiR-21的异常增高是促进多种癌症发展的重要因素。Chai等发现miR-21通过降低caspase-3和caspase-9表达抑制胶质瘤细胞的凋亡[2]；Shi等人发现miR-21通过增加Bcl-2/Bax水平抑制药物引起的胶质瘤细胞的凋亡[12]。因此，有效抑制miR-21的表达是治疗肿瘤的重要途径。在本研究中，过表达MEG3可以降低细胞内miR-21的表达，从而降低Bcl-2/Bax水平和升高caspase-3表达促进胶质瘤细胞凋亡。而这些效果又可以被同时过表达MEG3和miR-21所逆转。这些结果表明，MEG3可以通过抑制miR-21来抑制胶质瘤细胞活力并促进其凋亡。而这也进一步支持了之前关于MEG3通过调控miR-21发挥抗肿瘤作用的研究。例如，MEG3可通过调整miR-21抑制宫颈癌的发展[13]。

综上所述，本研究证实了MEG3通过抑制miR-21抑制胶质瘤活力并促进其凋亡，这一发现将有助于寻求更加有效的治疗胶质瘤的药物和靶点。