基于PI3K/Akt信号通路的汉黄芩素抗骨肉瘤作用机制研究

段大鹏 刘珊珊 李伟伟 冯 敏 姬 乐 秦 静

众所周知，骨肉瘤又称成骨肉瘤，是青少年儿童最常见的恶性骨肿瘤，其在早期即可发生远处转移，死亡率较高[1-3]。然而，人体骨组织密度大、药物渗透性差，加上其他复杂的生理生化原因，环磷酰胺、顺铂、阿霉素等传统抗肿瘤药物很难到达患病部位，因此治疗效果不佳[4-6]。

有学者发现，汉黄芩素(5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮，Wogonin)具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管形成等作用[7-8]。PI3K/Akt信号通路广泛参与细胞生长、增殖及分化调节，在凋亡调控中具有重要地位，是参与肿瘤发生、发展等过程的重要信号通路之一。汉黄芩素抗肿瘤作用机制涉及了多条重要细胞信号通路[9-10]，然而其对人骨肉瘤MG-63细胞中PI3K/Akt信号通路是否有影响尚未见有文献报道。本研究基于既往研究，研究汉黄芩素对骨肉瘤MG-63细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其与PI3K/Akt信号通路之间关系。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

汉黄芩素由中国食品药品检定研究院提供，用PBS溶解后，配制成适合浓度；人骨肉瘤MG-63细胞株购自上海生命科学研究院细胞资源中心；COX-2、Caspase3及p-Akt抗体购自Santa Cruz公司；双抗购自山东鲁抗制药公司；二甲基亚砜(DMSO)、四氮噻唑盐(MTT)等购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养

将液氮中储存的MG-63细胞取出，放入37℃水浴箱中，溶化后吸出细胞悬液，注入离心管，弃上清后移至培养瓶。DMEM培养基中含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL链霉素，培养箱条件为37℃、5% CO2。在光学显微镜下观察，当细胞贴壁融合度约为80%时传代，取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3 MG-63细胞增殖活性实验

对数生长期的MG-63单细胞悬液按组接种于96孔培养板中，分别加入含0、50、100及200 μmol/L汉黄芩素的培养液。分别于24 h、48 h及72 h后加入20 μL MTT，4 h后加DMSO 10 min。采用酶联免疫检测仪测每孔吸光度(OD)值，以空白对照孔OD值调零，计算细胞生长抑制率。以上实验均重复3次。

1.4 细胞凋亡实验

MG-63细胞用0.25%胰酶消化，以105/mL细胞密度接种于细胞培养板中。设0、50、100及200 μmol/L 4个组别，按组别加入不同浓度汉黄芩素。采用Annexin V/PI双染色法。胰酶消化后，离心收集细胞，调节细胞浓度。取100 μL细胞悬液分别加500 μL的1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC及10 μL PI，反应10 min，上流式细胞仪进行分析。

1.5 细胞划痕实验检测MG-63细胞迁移能力

取对数期生长的MG-63细胞，0.25%胰酶消化后制成单细胞悬液，以105/mL细胞密度接种于6孔板中。待细胞贴壁后，更换培养液，按组别加入不同浓度汉黄芩素(0、50、100、200 μmol/L)继续培养。当细胞铺满80%时吸出培养液，Marker笔在6孔板背面作标记，移液器枪头垂直于标记线划痕，PBS液冲洗3次，去除划痕处的细胞；24 h后在倒置显微镜下观察细胞迁移并拍照。

1.6 透射电镜检测超微结构

MG-63细胞采用不同浓度汉黄芩素(0、50、100、200 μmol/L)处理后，0.25%胰酶消化，用2.5%戊二醛固定，送西安交通大学医学院电镜室观察并拍照。

1.7 Western blot法检测COX-2、Caspase-3及p-Akt蛋白表达

按组别加入不同浓度汉黄芩素(0、50、100、200 μmol/L)至MG-63细胞悬液中，提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度。按《分子克隆实验指南》所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部结束电泳，取下凝胶并作标记，入电转缓冲液平衡5 min后转膜。纤维素膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。然后抗原抗体反应，并用辣根过氧化物酶化学增强剂显色反应。蛋白的表达水平根据GAPDH进行标化，通过软件进行灰度扫描、定量。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 汉黄芩素对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响

0、50、100、200 μmol/L组在72 h的细胞增殖抑制率分别为3.54±0.09%、20.9±2.33%、28.2±4.01%、47.2±8.11%，50、100、200 μmol/L组与0 μmol/L组相比较，差异有统计学意义(P<0.05)； 200 μmol/L组细胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h分别为18.2±3.33%、31.4±5.25%、47.2±8.11， 48 h、72 h时与24 h相比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

2.2 汉黄芩素对MG-63细胞凋亡的影响

流式细胞术结果发现，各组不同浓度(50、100、200 μmol/L)汉黄芩素处理MG-63细胞后，其凋亡指数分别为23.98%、36.47%、55.72%，显著高于对照组(0 μmol/L)的11.43%，差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。

表1 MG-63细胞生长抑制试验结果

Note：*P<0.05，compared with the negative control；#P<0.05，compared with the 24 h group.

图1 不同浓度汉黄芩素对MG-63细胞凋亡率的影响Figure 1 Wogonin induced apoptosis in MG-63 cells by flow cytometryNote：A，B，C and D stand for 0，50，100 and 200 μmol/L respectively.* P<0.05，compared with the negative control group.

2.3 汉黄芩素对MG-63细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验提示汉黄芩素对MG-63细胞迁移能力有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性(图2)。

图2 MG-63细胞划痕实验Figure 2 Wogonin inhibited the ability of migration in MG-63 cells

2.4 汉黄芩素对细胞超微结构的影响

透射电镜下观察，可见汉黄芩素可改变人骨肉瘤MG-63细胞超微结构，使细胞体积变小，核固缩，染色质边集，并可见凋亡小体(图3)。

2.5 汉黄芩素对MG-63细胞COX-2、Caspase-3和p-Akt蛋白表达的影响

Western blot结果发现，与对照组相比，实验组COX-2和p-Akt蛋白的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；实验组Caspase-3表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明汉黄芩素可抑制COX-2、p-Akt蛋白的表达，提高Caspase-3在MG-63细胞中的表达水平(图4)。

图3 透射电镜下MG-63细胞超微结构改变(×6000)Figure 3 Ultrastructural changes of MG-63 cells treated with Wogonin

图4 不同浓度汉黄芩素对MG-63细胞蛋白表达的影响Figure 4 The expression of COX-2，p-Akt and Caspase-3 protein in MG-63 cells treated with wogonin

3 讨论

骨肉瘤是常见的原发性间叶组织肿瘤，近年来发病率逐年增高[11-12]。骨肉瘤好发于血运丰富的长骨干骺端，恶性程度高，侵袭性和转移性很强，远处转移发生早，预后较差，死亡率高，严重危害青少年儿童的健康和生命[13-15]。Ma等[16]认为，尽管近年来以手术为主的综合治疗方法取得了很大进展，能暂时控制部分患者病情，但患者的5年存活率仍很低。由于骨组织密度高，渗透性差，大多数传统的抗肿瘤药物很难进入患病部位，因此研发新的抗肿瘤药物十分迫切。

黄芩是祖国传统中药，为唇形科黄芩属，产于辽宁、黑龙江、内蒙古、陕西、甘肃等地，俄罗斯东西伯利亚、蒙古、朝鲜、日本也有分布。汉黄芩素是从传统中药黄芩及半枝莲中分离提取的一种黄酮类化合物。Ge[17]及Wu等[18]试验研究表明，汉黄芩素具有抗肿瘤作用，可抑制肿瘤的生长，特异性诱导肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管形成等作用。汉黄芩素具有来源广泛、价格低廉、毒副作用少等优点，近年来受到越来越多的关注。本实验分别用0、50、100、200 μmol/L浓度汉黄芩素作用于MG-63细胞，MTT实验结果表明，汉黄芩素可使细胞增殖受到抑制，其细胞增殖抑制率随着浓度的提高而升高，并且与时间呈正相关关系，说明汉黄芩素不仅可以抑制人骨肉瘤增殖，并且具有时间和浓度依赖性。

细胞凋亡受到各种凋亡调控蛋白的调控，Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡调控的关键分子群，其中Caspase-3是凋亡执行的重要效应分子。本研究流式细胞术结果显示，各组不同浓度汉黄芩素处理MG-63细胞后，其凋亡指数分别为23.98%、36.47%、55.72%，显著高于对照组。Western blot结果进一步发现，各实验组Caspase-3表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义，表明汉黄芩素可提高Caspase-3在MG-63细胞中的表达水平，进一步诱导MG-63细胞凋亡。这与国内外相关研究结果一致[19]。

PI3K为一个调节亚基和一个催化亚基组成的异源二聚体蛋白，其调节亚基含有SH2和SH3结构域[20]。Liu等研究认为，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等生长因子均对PI3K具有激活作用[21-22]。Lim则证实了PI3K/Akt信号通路广泛参与细胞生长、增殖及分化调节，在凋亡调控中具有重要地位[23]。Rahmani及Chen的研究均证明PI3K/Akt信号通路是参与肿瘤发生、发展等过程的重要信号通路之一[24]，在许多肿瘤治疗中，PI3K/Akt信号通路活化成为抗肿瘤药物耐药的关键点[25]。本实验在证实汉黄芩素抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡作用同时，对其机制作了进一步探讨。本研究通过用不同浓度的汉黄芩素作用人骨肉瘤MG-63细胞，Western blot结果发现，与对照组相比，p-Akt蛋白的表达水平显著降低，表明汉黄芩素可抑制p-Akt蛋白在MG-63细胞中的表达水平，通过调控PI3K/Akt信号通路，从而抑制骨肉瘤细胞生长。

综上所述，汉黄芩素通过下调PI3K/Akt信号通路，进而抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖，诱导细胞凋亡。因此，深入开展汉黄芩素抗癌作用的研究将为骨肉瘤的治疗带来新的思路。