盐霉素对人黑色素瘤M21细胞增殖及自噬流的影响

刘雅菁 刘国钰 王树滨 方征宇

黑色素瘤是黑色素细胞恶性转化形成的恶性肿瘤，多发生于皮肤[1-2]，是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为3%～5%[3]。因其恶性程度极高，容易发生转移，早期诊断、早期治疗非常重要[4-5]。在过去三年中，针对黑色素瘤的靶向治疗和免疫治疗发展迅速，致死率降低[6]。但黑色素瘤细胞极易产生耐药性[7]，进而影响治疗效果，出现肿瘤的复发、转移，成为目前黑色素瘤治疗应用中十分棘手的问题。因此，亟需发现治疗黑色素瘤的新型药物或辅助药物。文献报道盐霉素能够特异性杀伤乳腺癌干细胞[8]，且对多种肿瘤细胞有杀伤作用[9-13]。但在黑色素瘤中的研究非常之少，对其机制的研究也尚无报道。本文选取人黑色素瘤经典细胞株M21细胞，检测盐霉素对其增殖的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人黑色素瘤M21细胞株(广州吉妮欧生物科技公司)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗(100 mg/mL链霉素、100 mg/mL青霉素)(美国GIBCO公司)；盐霉素(大连美仑生物技术有限公司)；DMSO(美国Sigma公司)；MTS液(美国Promega公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS蛋白裂解液、蛋白Marker(上海碧云天生物技术有限公司)；兔源LC3B抗体、兔源p62抗体、兔源B2M抗体、鼠抗兔二抗、鼠抗兔荧光二抗(美国CST公司)。

1.2 细胞培养

人黑色素瘤M21细胞株采用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基培养。细胞放置于37℃，5%的CO2细胞培养箱中培养，每2～3天传代1次，用0.25%的胰蛋白酶消化细胞后进行传代，实验取对数生长期细胞。

1.3 细胞株对盐霉素敏感性实验

将人黑色素瘤M21细胞接种到96孔板中，每孔3000个细胞，接种24 h后分别给予浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0 μM的盐霉素，每种浓度设置三个复孔。药物作用72 h后，加入MTS工作液20 μL，37℃孵育1 h，使用酶联免疫检测仪检测490 nm处吸光度(OD)值。细胞生存率=(OD加药组-OD空白)/(OD对照组-OD空白)×100%，利用细胞生存率计算半数抑制浓度(Half inhibitory concentration，IC50)。

1.4 Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡

将M21细胞接种于6孔板中，贴壁后加入1.0 μM盐霉素处理细胞。在药物处理0 h、12 h、24 h、48 h后收集细胞。用不含EDTA的胰酶消化后用PBS清洗两次，收集细胞。按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的说明书标记细胞后，用流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。

1.5 Western blot法检测蛋白表达情况

收集1.0 μM盐霉素分别作用0 h、12 h、24 h、48 h后的M21细胞，加入适量的蛋白裂解液，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。根据不同浓度进行定量，蛋白上样10%聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离蛋白后，将蛋白转印至PVDF膜上，用3%BSA溶液于常温下封闭30 min，分别加入稀释过的一抗，4℃孵育过夜。次日洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，洗涤后加入显影剂并通过Bio-Rad凝胶成像系统显影。

1.6 透射电镜样品的准备与前固定

M21细胞经1.0 μM盐霉素作用0 h、48 h后，用PBS洗涤细胞，将细胞刮下收集到离心管中。立即加入2.5%电镜用戊二醛0.5 mL固定，勿吹悬，室温固定1 h，4℃固定3 h，去除戊二醛加满PBS放置4℃待送检。将样品送至广州南方医科大学电镜室，经过脱水、浸透、包埋聚合、切片、染色等步骤，在透射电镜下观察。

1.7 免疫荧光观察p62蛋白的表达和定位

接种适量M21细胞到细胞爬片，贴壁后加入1.0 μM盐霉素分别作用0 h、48 h。室温PBS清洗后，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，可在摇床上轻摇。加入封闭液(10%山羊血清+0.1% Triton-X100+PBS)，封闭30 min。加入一抗，4℃孵育过夜。PBS摇荡冲洗3次，每次10 min。加入荧光二抗，室温孵育2 h。PBS清洗后，加入1×DAPI，室温染色5 min，用双蒸水清洗一次。晾干封片，在激光共聚焦显微镜下观察蛋白表达和分布情况。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 盐霉素对人黑色素瘤M21细胞增殖的影响

MTS检测结果显示，盐霉素对人黑色素瘤M21细胞具有明显的增殖抑制作用，在一定范围内细胞生存率随盐霉素浓度的增加而降低(P<0.05)。人黑色素瘤M21细胞对盐霉素极其敏感，IC50值仅为(1.38±0.18)μM(图1)。

2.2 盐霉素对人黑色素瘤M21细胞形态的影响

光学显微镜下观察1.0 μM盐霉素处理人黑色素瘤M21细胞不同时间后细胞的形态变化。正常M21细胞贴壁生长，分裂速度非常快，形态规则呈多边形。给药后，细胞分裂增殖速度减慢，形态变得不规则，继而变圆脱落，细胞浆内可见大量空泡样结构形成，空泡会逐渐变多且变大(图2)。

2.3 盐霉素对人黑色素瘤M21细胞凋亡的影响

为了研究盐霉素对M21细胞凋亡的影响，采用流式细胞仪检测盐霉素分别作用0 h、12 h、24 h、48 h后细胞凋亡的情况。结果可见随作用时间增加，凋亡细胞数量先增加后些许降低，但占总细胞数的百分比均较低，表明盐霉素仅能促进少量M21细胞发生凋亡，凋亡并不是盐霉素引起大量M21细胞死亡的主要作用机制(图3)。

图3 流式检测不同时间点盐霉素诱导细胞凋亡情况Figure 3 Salinomycin induced cell apoptosis in M21 cells at different time pointsNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

图2 1.0 μM盐霉素作用M21细胞不同时间后细胞形态图(×200)Figure 2 The effect of salinomycin(1.0 μM)on morphological changes of M21 cells

2.4 盐霉素对自噬相关蛋白LC3B的表达的影响

考虑到盐霉素作用后细胞内有空泡产生，猜测死亡机制可能与自噬有关。于是检测了自噬相关蛋白LC3B的表达。与对照组相比，加药组LC3B-Ⅰ蛋白表达水平随处理时间增加而降低。LC3B-Ⅱ蛋白在给药12 h时表达水平略有降低，之后逐渐增加。同时LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值也随处理时间增加而明显增加。与对照组相比，各组差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

图4 1.0 μM盐霉素作用后M21细胞内LC3B蛋白表达水平Figure 4 The expression of LC3B in M21 cells after treated with 1.0 μM salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

2.5 盐霉素对人黑色素瘤M21细胞自噬的影响

在电镜下直接看到自噬相关结构是检测自噬发生的金标准[14]。图5中可看到1.0 μM盐霉素处理48 h后M21细胞内形成了许多自噬小体(特征为具有双层或多层膜结构，其内包含细胞器和胞浆成分)，且出现大面积的空泡化。各结构放大图见图5右侧。

图5 电镜下观察1.0 M盐霉素对M21细胞自噬的影响Figure 5 The effect of salinomycin on autophagy in M21 cells

2.6 盐霉素对自噬特异性底物p62蛋白的影响

p62蛋白水平变化可以指示自噬流变化情况。由图6A可以看出，随着1.0 μM盐霉素作用时间增加，p62蛋白水平也有些许增加。为进一步验证p62蛋白的变化情况，进行了免疫荧光检测。由图6B所示，盐霉素作用后p62蛋白水平升高且逐渐在细胞质内聚集呈团状。

图6 1.0 M盐霉素对自噬特异性底物p62蛋白表达水平及定位的影响Figure 6 The expression level and localization of p62 protein in M21 cells treated with salinomycinNote：*P<0.05，**P<0.01，vs. the control group.

3 讨论

已有研究结果显示盐霉素不仅能对乳腺癌干细胞有特异性杀伤作用[8]，且对卵巢癌、前列腺癌、胶质瘤等多种肿瘤细胞均有较强的杀伤作用[9-13]。但其杀伤肿瘤细胞的作用机制各不相同[15]，已发现盐霉素能够通过抑制Akt/NF-κB信号通路、升高细胞内ROS水平诱导细胞发生凋亡[9-10]，能够通过ROS-AMPK-mTOR途径、内质网应激、线粒体功能障碍诱导细胞产生自噬[11-12]，还能够诱导细胞发生坏死[13]。但目前还未见有关于盐霉素作用于黑色素瘤的具体机制研究。

在本课题的研究中，我们发现盐霉素对人黑色素瘤M21细胞具有明显的增殖抑制作用，IC50值仅为(1.38±0.18)μM。同时发现随着1.0 μM盐霉素作用时间增加，细胞不仅增殖速度变慢，而且胞内产生了空泡样结构，逐渐增多变大。因此猜测盐霉素抑制人黑色素瘤M21细胞增殖的作用机制可能与自噬有关。

有文章报道盐霉素可以诱导某些细胞发生自噬，起到促进生存的作用，并减弱凋亡过程[16]。而一些研究发现盐霉素能够诱导异常自噬流，进而激活细胞凋亡的相关通路[17]。于是我们检测了自噬相关蛋白LC3B的水平变化，发现盐霉素可以诱导LC3B-Ⅱ蛋白水平和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的升高，即自噬小体的增多。因为在电镜下直接看到自噬小体是检测自噬发生的金标准，所以我们进行了电镜检测，进一步确证了自噬小体的存在，同时发现自噬小体增多继而导致堆积。

但自噬小体的增多可能归结于两种截然不同的因素，一是自噬流的增加，自噬小体增多最终会被溶酶体降解，二是自噬小体无法被降解，导致自噬小体越积越多[18]。同时有研究结果显示，在某些细胞中盐霉素能够引起自噬产生，导致细胞过度自噬[19]，而其他研究中发现盐霉素能够抑制自噬流，导致自噬小体堆积无法降解而引起细胞死亡[10-11]。在本研究中p62蛋白作为自噬特异性底物[20]，不仅其表达水平随时间增加且在自噬小体中逐渐聚集呈团状，表明自噬小体未被溶酶体降解，细胞内自噬流被抑制，从而导致自噬小体在细胞内堆积，最终引起细胞死亡。

综上所述，盐霉素具有抑制人黑色素瘤M21细胞增殖的作用，其机制可能与诱导自噬小体增多、抑制细胞内自噬流有关，但具体分子机制需进一步进行研究。本研究结果为盐霉素在黑色素瘤中的作用机制增添了新的研究结果，为盐霉素的进一步研究与临床应用提供实验依据和理论基础，具有临床应用潜力。