RASA1与Ras-MAPK信号通路在URSA滋养细胞中的表达及临床意义

张丹瑜，张竣，肖云敏，钱卫平

（1.汕头大学医学院，广东　汕头　515041；2.深圳市人民医院计划生育科，广东　深圳　518000；3.深圳市人民医院龙华分院，广东　深圳　518000；4.北京大学深圳医院生殖医学科，广东　深圳　518000）

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妇产科和生殖科常见疾病，是指连续发生两次或两次以上的自然流产者，病因复杂而多，能识别病因的仅占50%，还有半数属于不明原因复发性流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。对于URSA患者的诊断和治疗，临床上存在较大的争议，给临床医师及患者带来很大的困扰。因此，分析URSA的发生及发展机制，为研究URSA的发病及临床诊治提供新的思路和依据，具有重大的意义。

Ras蛋白是ras基因表达产物，在调节细胞生长及增殖中具有重要影响。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路位于 Ras下游，包括ERK、p38、JNK/SAPK等多个亚家族，其调控细胞增殖、分化和凋亡，与人类恶性肿瘤细胞的发生、发展密切相关。Ras-Raf-MEK-ERK途径是Ras-MAPK信号通路中最经典的信号转导途径之一，目前研究最为广泛。近期的研究证实，Ras-MAPK通路可以调控滋养细胞的侵袭能力，滋养细胞Ras-MAPK通路的异常可能导致复发性流产[1]。Ras p21蛋白活化子 1（Ras p21 protein activator 1，RASA1）属于 RasGTPase激活蛋白（GTPaseactivatingprotein，GAP）家族中的一员，具有让Ras蛋白失活从而抑制Ras信号通路的功能。现有研究表明，多种肿瘤的发生，与RASA1表达水平变化密切相关。但其在URSA的发生、发展中的作用研究鲜有报道。RASA1作为Ras-MAPK通路的直接调控蛋白，在滋养细胞中是否对Ras-MAPK通路具有调控作用，进而影响妊娠结局，现在仍是未知。为了研究RASA1在URSA发生、发展过程中的作用,我们采用RT-qPCR研究URSA与健康正常妊娠女性绒毛组织的滋养细胞中RASA1与Ras-MAPK信号通路的mRNA表达水平的差异，并观察其表达水平与临床的相关联系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1临床资料实验组：选取2017年8月～2018年2月在本院计划生育科就诊、孕龄49～63 d、B超检查未发现原始心管搏动、临床确诊稽留流产、行负压吸引术终止妊娠的URSA患者20例。对照组：同期同年龄段孕龄49～63 d、既往无任何不良孕产史且至少有一次或以上正常分娩史、本次妊娠无阴道流血等先兆流产症状、彩超检查胚胎发育正常（有胚芽和心管搏动且大小符合孕周）、要求行负压吸引术终止妊娠的健康正常妊娠女性20例。

筛选标本标准：研究对象需排除内分泌、外科及内科系统疾病；无血栓前状态；无女性生殖系统畸形及炎症；夫妻双方染色体及胚胎染色体无异常；无自身抗体如抗磷脂抗体、抗核抗体、抗DNA抗体、抗精子抗体、抗甲状腺抗体等；男方精液正常；孕期无剧烈运动、无服用含咖啡因类食品及嗜酒等不良生活习惯及嗜好等。

1.2RT-qPCR法采用RT-qPCR法分别测定URSA与健康正常妊娠女性绒毛组织的滋养细胞中的RASA1与Ras、ERK的mRNA含量。按试剂盒说明书进行操作，以管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参，RT-qPCR结果通过2-△△Ct法计算两组目的基因的mRNA相对表达水平，引物序列见表1。

表1　RT-qPCR实验所用引物序列Table 1　Primer sequences used in RT-qPCR experiment

1.3统计学方法使用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。采用t检验比较两组间的均数。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

在URSA患者滋养细胞中RASA1的mRNA含量高于健康正常妊娠女性滋养细胞中RASA1的mRNA含量。在URSA患者滋养细胞中RAS的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋养细胞中RAS的mRNA含量。在URSA患者滋养细胞中ERK的mRNA含量低于健康正常妊娠女性滋养细胞中ERK的mRNA含量，见表2。

表2　URSA患者和健康正常妊娠女性滋养细胞中RASA1、RAS、ERK的mRNA表达水平（x±s）Table 2　mRNAexpression levels of RASA1,RAS and ERK in trophoblast cell of URSApatients and normal pregnant women(x±s)

3　讨论

ras基因是一类原癌基因，在生物进化过程中高度保守，其表达的蛋白是Ras蛋白。Ras蛋白位于细胞内侧，能与鸟苷酸结合，是膜结合型的GTP/GDP结合蛋白。与GDP结合时处于非活化状态；反之，与GTP结合时为活化状态，因此Ras的作用可视为分子开关。MAPK属于细胞内广泛存在的一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以将细胞外刺激向细胞及细胞核内传导。MAPK包括ERK、p38、JNK/SAPK等多个亚家族，在Ras-MAPK信号通路中Ras-Raf-MEK-ERK通路目前研究得最为广泛。该通路调控着许多生理活动，如细胞增殖分化及细胞恶性转化等，与肿瘤细胞分化关系密切。近期的研究证实，Ras-MAPK通路可以调控滋养细胞的生物学功能，与复发性流产的发生密切相关。Zhu等[2]证实，复发性流产患者的滋养细胞中Ras-MAPK通路处于失活状态，进一步细胞实验证实，激活Ras-MAPK通路可以显著促进滋养细胞增殖。Liu等学者发现[3]，Ras-MAPK通路可以促进滋养细胞进入细胞周期的S期，从而促进滋养细胞增殖。细胞中有两类信号蛋白调节Ras活性，它们分别是Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（Rasguaninenucleotide exchange factors，Ras GEFs），在Ras GEFs作用下，GDP结合型转化为GTP结合型；另一个是Ras GTP酶活化蛋白（Ras GAPs），其促使GTP向GDP的转化。RASA1位于染色体5q13.1-14.3，在多种生长因子的作用下，可调控细胞的增殖、迁移和凋亡[4]。RASA1属胞浆蛋白，相对分子量为120 kD，其C端是GTP酶活化蛋白（GAP）结构域，具有催化作用，N端由PH、CaLB/C2、SH2、SH3等区域组成。RASA1可激活Ras GTP酶，能水解Ras GTP成Ras GDP而抑制Ras信号通路［5］。现有的研究表明：RASA1可以通过抑制Ras-MAPK通路进而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，其与多种肿瘤的发生密切相关［6-7］。

有关RASA1在URSA中的研究尚浅，本研究通过检测URSA患者和健康正常妊娠女性绒毛组织滋养细胞中RASA1的mRNA表达水平发现，RASA1在URSA患者滋养细胞中的表达率显著高于健康正常妊娠女性滋养细胞中（P＜0.05）；此外，本研究结果显示，RAS、ERK在URSA患者滋养细胞中表达率显著低于健康正常妊娠女性（P＜0.05），说明在URSA患者滋养细胞中，RASA1的mRNA升高，可能会导致Ras-MAPK通路的失活，进而让绒毛组织的滋养细胞增殖能力下降，凋亡增加，侵袭种植能力减弱，最终导致流产。

综上所述，滋养细胞Ras-MAPK通路的失衡在复发性流产中起重要作用，而RASA1与Ras-MAPK通路关闭失活密切相关。但是Ras-MAPK通路是如何发生异常的，其中的调控机制仍不清楚。本研究证实RASA1在URSA滋养细胞中的表达与健康正常妊娠女性有显著差异。但本研究仅采用RT-qPCR法检测了RASA1 mRNA的表达情况，还有很大的不足。将来有关RASA1及Ras-MAPK信号通路在URSA的进一步研究，有望为URSA的临床诊治提供新的方向。