维生素A对青鱼幼鱼生长、代谢、抗氧化能力和免疫能力的影响

2018-07-16吴成龙张易祥邵仙萍陈书健王春琳叶金云

动物营养学报 2018年7期

陈　炼　吴成龙　张易祥　邵仙萍　陈书健　王春琳　叶金云*

(1.宁波大学海洋学院，应用海洋生物学教育部重点实验室，宁波 315211; 2.湖州师范学院生命科学学院，浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室，湖州 313000)

维生素A是维持鱼类生长所必需的脂溶性营养物质之一，它参与了细胞分化、骨骼发育、繁殖以及免疫等鱼类的多个重要生理过程[1-2]。维生素A缺乏或者过量会对鱼类生长产生不良影响[3]。若鱼类饲料中缺乏维生素A或其前体——类胡萝卜素，可能导致其出现视力障碍、眼眶和鳍部出血、鳃盖变形以及死亡率增加等明显的症状[2-4]。如果鱼类摄食过量的维生素A，其肝脏和其他脂肪组织中则容易积累维生素A[5]，导致鱼类脊柱损伤[6]、生长缓慢[7]以及繁殖能力下降[2]等。

近些年来，有关维生素A最适需求量已经在草鱼(CtenopharyngodonIdellus)[8]、玳瑁石斑(Epinephelustauvina)[9]、团头鲂(Megalobramaamblycephala)[4]、罗非鱼(Oreochromisniloticus)[10]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[11]和大口黑鲈(Micropterussalmoides)[12]等鱼类上报道。研究发现，维生素A对鱼类的视觉功能、上皮细胞分化、骨骼发育、脂质代谢以及免疫功能都有重要的作用[1,12-15]。同其他脊椎动物一样，鱼类自身不能合成维生素A[15]，且对维生素A的需求受品种、个体大小、年龄以及环境因子的影响[2]。因此，探究水产动物饲料中适宜维生素A的含量对鱼类生长、代谢和免疫功能具有重要的指导意义。

青鱼(Mylopharyngodonpiceus)是我国传统的“四大家鱼”中唯一肉食性经济鱼类，由于其具有增强体质、延缓衰老、补气养胃等营养价值而被广泛养殖[16]。目前，关于青鱼营养学物质需求量的研究主要涉及脂肪[17]、糖[18-20]、蛋白质和氨基酸[20]以及矿物质[21]等，而对维生素这种微量元素需求量的探究仍然很缺乏。关于青鱼饲料中添加适量维生素从而提高其生长和免疫的报道中主要包括维生素C[22]、维生素D[23]和维生素E[24]，而有关维生素A的相关报道甚少。本研究以青鱼幼鱼作为主要试验对象，研究了饲料中不同含量的维生素A对青鱼幼鱼生长、代谢、抗氧化能力的影响，同时探讨不同维生素A含量对青鱼幼鱼免疫能力的影响，为青鱼幼鱼的人工配合饲料中维生素A添加量提供参考，为青鱼营养全面和价格合理的人工配合饲料开发提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验设计

采用单因素试验设计，以无维酪蛋白和明胶为蛋白质源，以糊精为糖源，以豆油和卵磷脂为脂肪源，同时添加氨基酸混合物、矿物质预混料以及不含维生素A的维生素预混料等制成基础饲料，饲料1～5中维生素A添加量分别为0、1 000、2 000、4 000、8 000、16 000 IU/kg，经过高效液相色谱法(Agilent-1100，Agilent，美国)检测后的实际含量分别为290、1 033、1 734、3 835、7 662和14 943 IU/kg。试验饲料组成及营养水平见表1。使用万能粉碎机将原粉碎，过筛，保证在40目以上，准确称取各种原料后进行充分混匀，将混合均匀的饲料原料用双螺杆挤条机加工制成直径为1.5 mm的条状，冷冻后切割为2～3 mm的颗粒，于40 ℃热空气烘箱中干燥烘干，最后将饲料装在双层的塑料袋中密封，置于-20 ℃中保存备用。

表1　试验饲料组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items饲料 Diets123456粗蛋白质 CP38.8138.5838.2538.8838.9238.36粗脂肪 EE4.985.095.104.935.115.09粗灰分 Ash2.582.652.592.612.652.67总能 Gross energy/(MJ/kg)14.9714.9314.8914.8314.8114.86

1)西格玛化工，美国 Sigma Chemical, USA。

2)化学试剂国药控股有限公司 Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.。

3)氨基酸混合物为每千克饲料提供 Amino acid mixture supplied the following for per kg of diets：赖氨酸 lysine 2.7 g，蛋氨酸 methionine 1 g，精氨酸 arginine 10.3 g。

4)中粮食品营销有限公司 Food Sales & Distribution Co., Ltd.。

5)矿物质预混料为每千克饲料提供Mineral mixture provided the following for per kg of diets：NaCl 100 mg，MgSO4·7H2O 1 200 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 3 g，FeSO4·H2O 80 mg，ZnSO4·H2O 50 mg，MnSO4·H2O 65 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，CoCl2·6H2O (1%) 50 mg，KI 0.8 mg，Na2SeO30.8 mg，沸石 zoelite 6.45 g。

6)维生素预预混料为每千克饲料提供Vitamin premix provided the following for per kg of diets：硫胺素 thiamin 25 mg，核黄素 riboflavin 45 mg，吡哆醇 pyridoxine 20 mg，VB120.2 mg，VK310 mg，肌醇 inositol 800 mg，泛酸 pantothenic acid 60 mg，烟酸 niacin acid 100 mg，叶酸 folic acid 20 mg，生物素 biotin 10 mg，VD33 mg，α-生育酚 α-tocopherol 300 mg，抗坏血酸ascorbic acid 1 g，微晶纤维素 microcrystalline cellulose 2.45 g。

7)浙江一星饲料集团有限公司ZhejiangYixingFeed Group Co., Ltd.。

8)诱食剂成分 Attractant composition：牛磺酸 taurine∶甜菜碱-盐酸 betain-HCl∶甘氨酸 glycine=1∶3∶3。

9)计算值 Calculated values。

1.2　试验鱼及饲养管理

试验选取个体规格相近、体质健壮的青鱼幼鱼540尾，初始体重为(5.35±0.16)g。将其随机分成6组，每组3个重复，每个重复放养青鱼幼鱼30尾。试验在驯化1周后进行，驯化期间，每天投喂维生素A缺乏组(290 IU/kg组)饲料2次，分别在08:00和17:00，日投喂量为每组鱼体重的3%。养殖期间每日观察青鱼幼鱼的体征变化，记录摄食情况和死亡率。饲养期为60 d，试验期间每天换1次水，每次换水量为1/3，所换的水来自人工蓄水池中至少曝气1 d的水，且均是反复循环状态的流动水，水温为26～33 ℃，光照与自然光照同步，pH在7.2左右，溶氧浓度为5.8 mg/L以上。

1.3　样品采集以及分析

饲养试验结束后，停止喂食24 h以排空肠道内容物，统计各缸内青鱼幼鱼总数，然后称其总重量，并在其中随机选取5条，称量体重和体长并记录，解剖取其血液和肝脏，并且称取肝脏重量，然后迅速投入到液氮罐中，之后转移至-80 ℃冰箱中保存。

试验饲料和全鱼粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量检测方法如下：采用凯氏定氮法(Kjeltec-2200,FOSS，丹麦)测定粗蛋白质含量；采用索氏抽提法(SoxtecTM-2043,FOSS，丹麦)测定粗脂肪含量；采用105 ℃恒温烘干失重法测定水分含量；采用马弗炉550 ℃ 14 h灼烧法测定粗灰分含量。饲料以及全鱼中的维生素A含量采用高效液相色谱法检测，每个样品测定2次。

肝脏α淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶等消化酶以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱苷肽转移酶(GST)等抗氧化相关酶活性的检测均采用南京建成生物工程研究所商品化检测试剂盒。肝脏丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)，血清溶菌酶(LYZ)活性及补体3(C3)和补体4(C4)含量也是采用南京建成生物工程研究所商品化检测试剂盒测定。

1.4　组织总RNA提取、反转录及相关基因表达量检测

1.4.1引物设计

采用Primer5.0和Oligo7.0软件共同设计LYZ、干扰素α(INFα)、铁调素(HEPC)、天然抗性相关巨噬蛋白(NRAMP)、C3和补体9(C9)等非特异性免疫基因的实时定量PCR引物(表2)。所有引物均由上海博尚生物科技有限公司合成。以β-肌动蛋白(β-actin)作为管家基因，验证各组织表达稳定性。

1.4.2总RNA的提取

血细胞总RNA采用TRIZOL试剂(Invitogen)提取，并用1%琼脂糖变性胶来检测总RNA的提取质量。利用PrimeScriptTM反转录试剂盒(TaKaRa，日本)，以3 μg总RNA为模板，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s反转合成cDNA。cDNA保存在-20 ℃用于基因检测。

1.4.3实时定量PCR

实时定量PCR过程参考Wu等[25]。反应在实时定量PCR仪(cfx96,Bio-Rad，美国)上进行，体系总体积是25 μL，其中包括1 μL的cDNA溶液，12.5 μL 2×SYBR Green Ⅰ Realtime PCR Master Mix(TaKaRa，日本)，正向引物0.2 μmol/L和反向引物0.2 μmol/L，补充加入双蒸水至25 μL。反应程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，59℃ 15 s，35个循环。基因表达相对定量采用2-ΔΔCt法[26]。

表2　实时定量PCR引物

1.5　计算公式

试验鱼的增重率(weight gain rate,WGR)、特定生长率(specific growth rate,SGR)、成活率(survival rate,SR)、饲料转化效率(feed conversion ratio,FCR)、肝体比(hepatosomatic index,HSI)、蛋白质效率(protein efficiency ratio,PER)、肥满度(condition factor,CF)计算公式如下：

WGR(%)=100×(终末均重-
初始均重)/初始均重；
SGR(%/d)=100×(ln终末均重-
ln初始均重)/试验天数；
SR(%)=100×试验结束鱼尾数/
试验开始鱼尾数；
FCR=鱼体增重(湿重)/饲料摄取量；
HSI=100×肝重/体重；
CF=100×末体重/末体长3；
PER=100×体重增加量(g)/
饲料蛋白质摄取量(g)。

1.6　数据统计与分析

试验所获得各项数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差(one-way ANOVA)分析，差异显著时，采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2　结　果

2.1　维生素A对青鱼幼鱼生长性能和体组成的影响

表2显示，饲料中维生素A含量为290 IU/kg，青鱼幼鱼的WGR和SGR显著低于其他各组(P<0.05)。随着饲料中维生素A含量的增加，WGR、SGR和PER都呈现先升高后下降的趋势，并在维生素A为3 835 IU/kg时达到最高值。随着饲料维生素A含量的增加，HSI呈现下降趋势，之后又逐渐升高；饲料维生素A含量为290 IU/kg时，HSI与1 033 IU/kg组相比较比差异不显著(P>0.05)，但显著高于其他各组(P<0.05)。饲料维生素A含量的不同对CF没有造成显著影响(P>0.05)。随着饲料中维生素A含量的增加，FCR呈现先下降后升高的趋势，在维生素A含量为7 662 IU/kg时获得最低值，但在饲料中维生素A含量为1 734～14 943 IU/kg的各组之间没有显著差异(P>0.05)。随着饲料中维生素A含量的增加，SR先升高后降低，且在饲料维生素A含量为1 033～14 943 IU/kg的各组间差异不显著(P>0.05)，同时在维生素A含量为7 662 IU/kg时获得最高SR。

维生素A含量对青鱼幼鱼体组成的水分、粗脂肪和粗灰分含量没有显著影响(P>0.05)。随着饲料中维生素A含量的增加，青鱼幼鱼的粗蛋白质含量呈现先升高后降低的趋势，且在饲料维生素A含量为7 662 IU/kg时，达到最高值，显著高于290 IU/kg组(P<0.05)。

通过折线模型分析，得到青鱼幼鱼WGR(y)与饲料中维生素A含量(x)效应折线关系为：y=0.104 3x+156.54，R2=0.953 5；y=-0.005 9x+404.12，R2=0.970 5。由此得出，青鱼幼鱼的维生素A需求量为2 246.64 IU/kg(图1)。

表3　维生素A对青鱼幼鱼生长性能和体组成的影响

同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Values in the same row with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2　维生素A对青鱼幼鱼肝脏代谢酶活性和抗氧化能力的影响

表4显示，肝脏中的α淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶活性都随着饲料中维生素A含量的升高而出现先增加后下降的趋势，α淀粉酶和弹性蛋白酶活性均在3 835 IU/kg组达到最高值，胰蛋白酶和糜蛋白酶活性均在7 662 IU/kg组获得最大值。且这4种代谢酶活性在3 835 IU/kg组和7 662 IU/kg组之间没有显著差异(P>0.05)。

表5显示，随着饲料维生素A含量的增加，肝脏CAT、GPx、GR活性和T-AOC都呈现先升高后下降的趋势；饲料维生素A含量为3 835 IU/kg时，肝脏T-AOC达到最大值。饲料维生素A含量为7 662 IU/kg时，肝脏CAT、GPx和GR活性获得最高值。肝脏SOD活性随着饲料维生素A含量的增加呈现持续增加的趋势，并在14 943 IU/kg组达到最高值，与290、1 033、1 734 IU/kg组差异显著(P<0.05)。肝脏GST活性和MDA含量随着饲料维生素A含量的增加均呈现先下降后升高的趋势，并在3 835 IU/kg组达到最低值。在3 835 IU/kg组和7 662 IU/kg组间，肝脏中抗氧化指标无显著差异(P>0.05)。

图1　饲料维生素A含量与青鱼幼鱼增重率的关系

2.3　维生素A对青鱼幼鱼非特异性免疫能力的影响

表6显示，血清中LYZ活性及C3和C4含量都随着饲料维生素A含量的升高而出现先增加后稳定的趋势，其中血清LYZ活性和C3含量在3 835 IU/kg组达到最高值，血清C4含量在7 662 IU/kg组获得最大值。

图2显示，血细胞中LYZ基因表达量呈现先升高后降低的趋势，并在3 835 IU/kg组达最高，显著高于其他各组(P<0.05)，但在1 734、7 662和14 943 IU/kg组间无显著差异(P>0.05)。INFα基因表达量在1 734 IU/kg组到达最高值，与3 835和7 662 IU/kg组没有显著差异(P>0.05)，显著高于其他各组(P<0.05)。HEPC基因的表达量在饲料维生素A含量为1 734～14 943 IU/kg时差异不显著(P>0.05)，但在1 734 IU/kg组达到最高值，且与290和1 033 IU/kg组差异显著(P<0.05)。NRAMP基因表达量呈现先升高后降低趋势，并在1 734 IU/kg组获得最高值，显著高于其他各组(P<0.05)。C3基因表达量在1 734 IU/kg组到达最高值，但与3 835和7 662 IU/kg组间无显著差异(P>0.05)，显著高于其他各组(P<0.05)。290 IU/kg组C9基因表达量显著低于其他各组(P<0.05)，并在7 662 IU/kg组到最高值，但在1 734、7 662和14 943 IU/kg组之间无显著差异(P>0.05)。

表4　维生素A对青鱼幼鱼肝脏代谢酶活性的影响

表5　饲料中添加维生素A对青鱼幼鱼肝脏抗氧化能力的影响

续表5项目Items饲料维生素A含量 Dietary vitamin A content/(IU/kg)2901 0331 7343 8357 66214 943过氧化氢酶 CAT/(U/mg prot)17.79±1.21a21.77±2.10b26.85±2.39c29.64±2.11cd32.45±1.80d27.19±1.27c谷胱甘肽过氧化物酶 GPx/(U/mg prot)341.56±26.06a387.62±34.09ab469.33±23.21bc558.34±66.74d572.75±70.15d515.21±33.00cd谷胱甘肽还原酶 GR/(U/g prot)113.20±11.29a148.00±20.92ab148.30±19.86ab177.02±18.48bc211.40±27.93c162.79±24.18b谷胱苷肽-S-转移酶 GST/(U/mg prot)3 127.95±73.95c2 940.60±124.74abc2 825.24±66.31ab2 716.00±130.51a2 729.37±196.69a3 038.70±198.52bc丙二醛 MDA/(nmol/mg prot)13.22±1.80c10.54±0.88b8.46±0.93ab7.97±1.29a8.53±0.84ab9.30±1.24ab总抗氧化能力 T-AOC/(U/mg prot)2.59±0.30a3.16±0.24b3.64±0.35bc3.98±0.36c3.92±0.27c3.69±0.14bc

表6　维生素A对青鱼幼鱼血清免疫指标的影响

3　讨　论

3.1　维生素A对青鱼幼鱼生长性能和体组成的影响

本研究结果显示，维生素A是促进青鱼幼鱼生长的必需营养素，能够显著影响青鱼幼鱼的WGR、SGR、HSI、PER、FCR和SR等指标，这与在其他鱼类中研究结果一致[4,8,12,27-28]。本研究以WGR为指标，采用折线模型分析，得出青鱼幼鱼的维生素A需求量为2 246.64 IU/kg，这与玳瑁石斑[9]和虹鳟[29]、大口黑鲈[12]、花鲈(Lateolabraxjaponicus)[30]和团头鲂[4]等肉食性鱼类对饲料维生素A的需求量接近。同时青鱼幼鱼的维生素A需求量显著高于史氏鲟鱼(Acipenserschrencki)[28]，但显著低于牙鲆(Paralichthysolivaceus)[31]和杂交罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)[32]，这表明维生素A的需求量差异可能与鱼类品种不同有关[12]。另外本研究发现，当维生素A含量仅为290和1 033 IU/kg时，青鱼幼鱼的生长受到显著抑制，这与在大口黑鲈[12]、建鲤(Cyprinuscarpiovar. Jian)[3]和牙鲆[31]中的研究结果相似。与适量维生素A组(3 835 IU/kg组)相比，过量维生素A(14 943 IU/kg)显著抑制青鱼幼鱼的生长，这与在牙鲆[33]、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[27]和美国红鱼(Sciaenopsocellatus)[34]中的研究结果一致。上述研究结果进一步证明了饲料中维生素A缺乏或过量均会导致养殖青鱼出现生长抑制现象[3]。但是对于维生素A缺乏或过量抑制鱼类生长的分子机制有待进一步深入研究。

本研究结果显示，饲料中不同维生素A含量对青鱼幼鱼全鱼的水分、粗灰分和粗脂肪含量影响不显著。鱼体粗蛋白质含量在7 662 IU/kg组达到最大值，与维生素A缺乏组差异显著，但与其他试验组间无显著差异，相似的研究结果也出现在建鲤[3]、大口黑鲈[12]和斜带石斑鱼[27]等鱼类中。同样在这几种鱼类中研究结果也显示，鱼体粗蛋白质含量的变化趋势与PER变化趋势一致，这说明维生素A的缺乏或过量都会降低青鱼幼鱼对蛋白质的利用，并且维生素A参与了鱼体营养物质的代谢从而影响了鱼体组成[12,27]。此外，随着饲料中维生素A的含量增加，青鱼幼鱼的粗脂肪含量呈现先升高后平稳的趋势，这与在大口黑鲈[12]、花鲈[2]和牙鲆[31]等鱼类中的研究结果一致，但是不同饲料维生素A含量对团头鲂[4]和草鱼[5,8]的鱼体组成无显著影响，这可能是鱼的种类不同而产生的生物学差异。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).

图2维生素A对青鱼幼鱼血细胞免疫相关基因表达量的影响

Fig.2Effects of vitamin A on gene expression levels related to immunity in blood cell of juvenile black carp (Mylopharyngodonpiceus)

3.2　维生素A对青鱼幼鱼肝脏代谢酶活性的影响

作为储存和代谢脂溶性维生素A的主要器官[35]，肝脏中代谢酶的活性较高[36]，能够更好地反映出养殖动物的代谢特征。本研究发现，青鱼幼鱼中肝脏α淀粉酶活性随着维生素A含量的升高而呈现先升高后降低的趋势，这表明饲料中添加适宜剂量的维生素A能够改善青鱼幼鱼对碳水化合物的消化吸收和利用，这与在高等动物中的研究结论较为一致[37]。此外，随着饲料维生素A含量的升高，青鱼幼鱼肝脏中各类蛋白酶活性与鱼体粗蛋白质含量和PER的变化趋势一致，这表明饲料中添加适宜剂量的维生素A能够促进青鱼幼鱼对饲料蛋白质的消化、吸收和利用，进而促进鱼体的生长和蛋白质的沉积[12,27,31]。而维生素A缺乏降低了青鱼的消化能力，从而降低其对营养物质(蛋白质等)的利用率，并产生生长抑制现象[3]。但是对于维生素A调控动物体代谢酶的分子机制仍需深入研究。

3.3　维生素A对青鱼幼鱼肝脏抗氧化能力的影响

与其他耗氧生物一样，鱼类细胞也极易受到超氧阴离子、过氧化氢等活性氧分子的非特异性攻击。而鱼类在进化过程中也产生一系列抗氧化分子来抵御氧化损伤[38-39]，包括非酶性抗氧化分子(GSH等)以及抗氧化酶(如CAT、SOD、GST、GPx和GR等)。SOD主要催化超氧阴离子转化生成过氧化氢，从而降低超氧阴离子对细胞造成的氧化损伤。与在美国红鱼[34]、草鱼[8]、大口黑鲈[12]中的研究结果一致，本研究发现SOD活性随着维生素A含量的增加也呈现先递增后趋于稳定的趋势，这也表明适量的维生素A有利于青鱼幼鱼抵抗氧化应激[14]。同时，CAT和GPx可以将过氧化氢催化生成无毒副作用的水和氧气分子。肝脏CAT、GPx和GR活性在本研究中均呈现先升高后降低的趋势，表明在一定范围内维生素A的添加可以提高抗氧化酶的活性。作为机体抗氧化能力的一个综合指标，T-AOC也呈现与CAT、GPx和GR活性相似的变化趋势，这表明饲料中添加适量的维生素A能够更好地清除鱼体内过多的活性氧自由基分子，进而促进抗氧化系统平衡[38]。肝脏GST活性和MDA含量的高低能够直观地反映动物细胞受到氧化损伤的程度。本研究发现，与维生素A缺乏组(290 IU/kg组)相比，1 734、3 835和7 662 IU/kg的维生素A能够下调鱼体肝脏中GST活性和MDA含量，随后在过量组(14 943 IU/kg组)又出现升高，这与在大口黑鲈中的研究结果一致[12]。这表明适量的维生素A可在一定程度上减轻青鱼幼鱼细胞内过量活性氧自由基攻击造成的氧化受损[38]。因此，在饲料中适当添加维生素A可以提高青鱼幼鱼抗氧化反应能力。

3.4　维生素A对青鱼幼鱼非特异性免疫能力的影响

LYZ在鱼类非特异性免疫机制中担负重要角色，其基因表达量能够直接反映鱼类免疫反应的高低，并且已经成为水产动物免疫反应的重要指标[25,28]。本研究中，维生素A含量为3 835 IU/kg时，青鱼幼鱼血细胞中LYZ基因表达量以及血清中LYZ活性均达到最高,此结果与在罗非鱼和建鲤等鱼类[3,10,12]中的研究结果一致，这也证明适量的维生素A能够通过提高LYZ基因表达量和LYZ活性来增强动物体的免疫力。但Thompson等[40]在大西洋鲑(SalmosalarL.)中未发现类似现象，这可能是鱼类品种差异造成的。干扰素不仅是高等动物机体抵抗病原体尤其是病毒感染的第1道防线，也是低等脊椎动物-鱼类的重要防御因子和免疫细胞的激活因子[41]，而且干扰素基因的高表达量也能够体现出动物体免疫能力的强弱[19]。结合上述发现以及本研究结果，可以进一步证明饲料中添加适量的维生素A可以通过提高青鱼幼鱼INFα基因表达量提高鱼类抗病力。NRAMP和HEPC是动物体内重要的抗菌肽和杀菌剂，在非特异性免疫调控和增强获得性免疫防御中发挥重要作用[42]。NRAMP还能够激活巨噬细胞来提高抗菌剂活性分子——一氧化氮(NO)的生成量进而增强动物体的免疫力[43]。HEPC能够通过结合铁转运蛋白进而提高巨噬细胞对病原体的内吞作用和蛋白质水解作用[42]。因此，饲料中添加适量的维生素A能够通过提高NRAMP和HEPC基因表达量来增强青鱼的非特异性免疫防御能力[25]。作为动物体液免疫系统的重要因子，经旁路途径或裂解途径激活的补体分子首先与外源细菌结合，然后通过吞噬细胞表面相应受体来促进吞噬作用，实施对外源入侵物的裂解和破坏，进而提高动物体的免疫防御能力[44-45]。作为激活补体系统的关键分子，青鱼幼鱼血清中C3和C4含量能够被适量的维生素A显著提高，这与在团头鲂[4]、大西洋鲑鱼[40]、虹鳟[29]、真鲷(SparusaurataL.)[46]、牙鲆[47]和大口黑鲈[12]等鱼类中的研究结果一致。上述研究结果也显示，维生素A含量对青鱼幼鱼的非特异性免疫指标的影响较为一致，这进一步证明饲料中适量的维生素A对于维持青鱼幼鱼健康和免疫防御具有重要意义。