吡咯喹啉醌二钠对肉仔鸡的生物安全性评价

2018-07-16孙光明董雪玉廖秀冬张丽阳郭艳丽罗绪刚

动物营养学报 2018年7期

孙光明　董雪玉　廖秀冬　张丽阳　郭艳丽*　吕　林*　罗绪刚

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所矿物元素营养研究室，北京 100193)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是20世纪60年代人类继烟酰胺[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)]和核黄素[黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黄素单核苷酸(FMN)]后发现的又一种氧化还原酶的辅酶[1]，PQQ广泛存在于动植物体内，但动物自身不能合成，主要依靠肠道微生物合成和外源摄入获取，PQQ被动物摄入后，在小肠被吸收，经肾脏排出。外源PQQ对维持动物机体正常生理功能至关重要。研究发现，PQQ具有促进机体生长和提高细菌对毒性及辐射的耐受性[2-3]、抗氧化应激[4]、防治肝损伤[5]、调节脂质代谢[6]等功能。目前PQQ已被归入B族维生素，是机体必需的一种营养因子，在生产和应用中的主要形式是吡咯喹啉醌二钠(pyrroloquinoline quinone disodium salt，PQQ·Na2)[7]。Ghirmay[8]在肉仔鸡饲粮中添加0～0.8 mg/kg PQQ·Na2时发现，饲粮添加0.2 mg/kg PQQ·Na2可以提高肉仔鸡饲料转化效率、42日龄屠宰性能、血浆抗氧化能力并降低血浆脂质过氧化物含量；饲粮添加0.1 mg/kg PQQ·Na2可提高血浆溶菌酶活性。孙丽敏[9]在蛋鸡饲粮中添加0、0.08、0.80和1.60 mg/kg PQQ·Na2时发现，饲粮中添加适量PQQ·Na2(0.80 mg/kg)可提高产蛋率，增强产蛋鸡和鸡蛋抗氧化能力，有降低鸡蛋胆固醇含量的趋势。但是，目前PQQ·Na2的研究大多集中在改善动物生长性能和提高抗氧化能力等方面，关于PQQ·Na2的安全性评价主要集中在大鼠和人上[10-11]，对肉仔鸡的安全性评价尚未见报道。本研究通过测定肉仔鸡生长性能、血液生理和血浆生化指标、器官指数和组织结构变化，以评价玉米-豆粕型饲粮中PQQ·Na2添加水平对1～21日龄和22～49日龄肉仔鸡的影响，为确定PQQ·Na2在肉仔鸡饲粮中最高添加水平的安全系数提供科学依据，以确保其在肉仔鸡生产中的安全应用。

1　材料与方法

1.1　试验材料

PQQ·Na2产品由上海优佰福生物科技有限公司提供，其中PQQ·Na2有效含量达到99%以上。试验饲粮中添加的PQQ·Na2为0.1%的预混剂产品。

1.2　试验设计

试验采用单因子完全随机设计。从北京华都肉鸡公司购买300只健康商品代1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡(公母各占1/2)，从中按体重和性别选取240只，随机分为4个组，每组6个重复(笼)，每个重复10只鸡(公母各占1/2)。

根据本实验室前期PQQ·Na2对肉仔鸡的生物学有效性评价研究结果，得到肉仔鸡玉米-豆粕型饲粮中PQQ·Na2的适宜添加水平为0.1～0.5 mg/kg，将0.1 mg/kg看作是肉仔鸡饲粮中PQQ·Na2的最低有效推荐添加水平，以及根据农业部颁布的《饲料和饲料添加剂畜禽靶动物耐受性评价试验指南(试行)》中的有关规定，共设置4个组，即不添加PQQ·Na2的对照组、PQQ·Na2最高有效添加水平组(为最低有效推荐添加水平的3倍)以及分别为最高有效添加水平组5和10倍的2个PQQ·Na2高水平添加组，即4个组的饲粮PQQ·Na2添加水平分别为0、0.3、1.5和3.0 mg/kg。试验期为49 d，分为2个阶段：1～21日龄和22～49日龄。

1.3　试验饲粮

参照NRC(1994)[12]家禽营养需要量中肉仔鸡营养建议量配制试验鸡1～21日龄和22～49日龄的玉米-豆粕型基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1，并按上述试验设计分别在各阶段基础饲粮中通过调整玉米淀粉的用量而配制4种试验饲粮。各组试验饲粮均以粉料形式喂给试验鸡只。

1.4　饲养管理

饲养管理和常规免疫按《AA肉仔鸡饲养管理手册》进行。鸡只自由采食和饮水。试验期每天观察记录鸡只健康状况，如有鸡只死亡，立即解剖，观察分析病理死因，并结料。分别于试验期第21和49天以重复(笼)为单元称鸡空腹体重和剩料量，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)。

表1　基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础)

续表1项目 Items含量 Content1^21日龄 1 to 21 days of age22^49日龄 22 to 49 days of age蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.90 0.72 钙 Ca1.00 0.90 非植酸磷 NPP0.45 0.35

1)饲料级 Feed grade。

2)微量成分为每千克饲粮提供 Micronutrients provided the following per kilogram of diets：1～21日龄 1 to 21 days of age，VA 15 000 IU， VD34 500 IU，VE 24 IU，VK33 mg，VB13 mg，VB29.6 mg，VB63 mg，VB120.018 mg，泛酸钙 pantothenic acid calcium 15 mg，烟酸 niacin 39 mg，叶酸 folic acid 1.5 mg，生物素 biotin 0.15 mg，氯化胆碱 choline chloride 700 mg，Zn (as zinc sulfate) 60 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Mn (as manganese sulfate) 110 mg，Fe (as ferrous sulfate) 40 mg，I (as potassium iodide) 0.35 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，金霉素 chlorotetracycline 50 mg；22～49日龄 22 to 49 days of age，VA 10 000 IU，VD33 000 IU，VE 16 IU，VK32 mg，VB12 mg，VB26.4 mg，VB62 mg，VB120.012 mg，泛酸钙 pantothenic acid calcium 10mg，烟酸 niacin 26 mg，叶酸 folic acid 1 mg，生物素 biotin 0.1 mg，氯化胆碱 choline chloride 500 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg，Fe (as ferrous sulfate) 30 mg，Zn(as zinc sulfate)40 mg，I (as potassium iodide) 0.35 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg。

3)粗蛋白质和钙为实测值，其余营养水平为计算值。CP and Ca were measured values, while the other nutrient levels were calculated values.

1.5　样品采集与制备

于饲料配制前采集玉米、豆粕饲料原料样品，分析粗蛋白质和钙含量，使配制的饲粮中上述关键营养素含量与饲粮配方值尽可能接近，并在配制饲粮时现场采集样品，四分法缩小样品量后粉碎过200目筛，置于自封袋中低温干燥保存，以备分析饲粮粗蛋白质和钙含量。

分别于试验鸡的21和49日龄时，所有鸡只禁食而不禁水过夜后，次日08:00分别称鸡只空腹个体活重，从每个重复笼中按笼平均体重选取2只鸡(公母各1只)，翅静脉采血10～15 mL。其中，取第1份抗凝血测定血液常规生理指标；取第2份抗凝血于3 000 r/min离心10 min，分离血浆并分装，于-20 ℃冻存，以备分析血浆生化指标。各重复笼2只鸡的全血或血浆按同等比例合并为1个样品进行分析。

于上述第49日龄鸡只采血结束后，将所有采血鸡只屠宰，摘取胸腺、法氏囊、脾脏、胰脏、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、腺胃和肌胃，另取出十二指肠、空肠和回肠挤出其中内容物，分别称重，计算脏器指数；测量十二指肠、空肠、回肠长度，计算小肠各段长度指数；同时观察记录各个脏器的形态变化。

脏器指数(%)=(器官重量/活体体重)×100；
小肠各段长度指数(%)=(小肠各段长度/
小肠总长度)×100。

各器官称重后，每个组从其中3个重复(笼)各取1只公鸡、另3个重复(笼)各取1只母鸡的部分肝脏、肾脏、心脏、肺脏和脾脏，放入装有4%福尔马林溶液的棕色瓶中固定，以备制作切片，观测其组织结构。

1.6　样品分析

1.6.1饲料原料和饲粮样品分析

样品经浓硝酸和高氯酸湿法消化后，在IRIS IntrepidⅡ等离子体发射光谱仪(TE，美国)上测定饲料原料和饲粮中钙含量；用比色法[13]测定磷酸氢钙中的总磷含量；饲粮中的粗蛋白质含量按凯氏定氮法[14]测定。

1.6.2全血、血浆指标分析

采用KX-21血细胞自动分析仪(SYSMEX，日本)测定血液常规生理指标(血红蛋白含量、红细胞压积等)；采用TBA-40FR全自动生化分析仪(Toshiba，日本)测定血浆生化指标(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酸磷酸激酶、碱性磷酸酶活性及尿酸氮、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆红素、肌酐、总胆固醇和甘油三酯含量)。

注意，如果手足干裂只见于一只手或一只脚，伴有轻度瘙痒，有可能是手足癣（手气、脚气），可以在上述第二步治疗时加用治疗脚气的药膏。如果手或脚同时出现肥厚、粗糙的皮损，并且还经常扩展到手足背，伴有水疱，瘙痒明显，很有可能是湿疹，这时应配合内服抗过敏药或除湿止痒的中药，局部加用皮质激素类软膏，疗效更明显。

1.6.3组织结构检查

按Deng等[15]和Ashraf等[16]报道的方法进行组织结构检查。主要步骤为：将固定的标本经水洗、透明、浸蜡、包埋等处理后，制成5 μm的切片，经苏木精-伊红(HE)染色后，在显微镜下观察肝脏、肾脏、心脏、肺脏和脾脏组织结构形态变化，并用图像采集系统采集相应组织图像。

1.7　数据统计分析

所有数据均采用SAS 9.0[17]软件中的一般线性模型(GLM)程序进行方差分析，差异显著者，以最小显著差异(LSD)法比较各组间的差异显著性。数据以平均值表示，以0.05作为本研究中各项数据的差异显著性检验水平。

2　结果与分析

2.1　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡生长性能的影响

由表2可见，饲粮PQQ·Na2添加水平对1～21日龄、22～49日龄和1～49日龄肉仔鸡ADG、ADFI、F/G均无显著影响(P>0.05)。这表明在本试验条件下，饲粮添加不同水平PQQ·Na2对肉仔鸡的生长性能均无不良影响。

表2　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡生长性能的影响

数据表示6个重复笼(n=6)的平均值，每个重复笼10只鸡(公母各占1/2)。

Values represent the mean of six replicate cages (n=6) with 10 chicks (half male and half female) per cage.

2.2　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血液生理指标的影响

由表3可见，饲粮PQQ·Na2添加水平对21、49日龄肉仔鸡血液血红蛋白含量、红细胞压积、白细胞计数和红细胞计数均无显著影响(P>0.05)。这表明在本试验条件下，饲粮添加不同水平PQQ·Na2对肉仔鸡的血液生理指标均无不良影响。

表3　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血液生理指标的影响

数据表示5或6个重复笼(n=5或n=6)的平均值，每个重复笼2只鸡(公母各1只)。

Values represent the mean of five or six replicate cages (n=5 orn=6) with 2 chicks (one male and one female) per cage.

2.3　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血浆生化指标的影响

由表4可见，饲粮PQQ·Na2添加水平对21、49日龄肉仔鸡的各项血浆生化指标均无显著影响(P>0.05)。这表明在本试验条件下，饲粮添加不同水平PQQ·Na2对肉仔鸡的血浆生化特性均无不良影响。

表4　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血浆生化指标的影响

数据表示5或6个重复笼(n=5或n=6)的平均值，每个重复笼2只鸡(公母各1只)。

Values represent the mean of five or six replicate cages (n=5 orn=6) with 2 chicks (one male and one female) per cage.

2.4　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡脏器指数的影响

由表5可见，饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡各脏器指数均无显著影响(P>0.05)，且各脏器外观未观测到任何异常变化。这表明在本试验条件下，饲粮添加不同水平PQQ·Na2不影响肉仔鸡内脏器官的发育。

2.5　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡主要脏器组织结构的影响

由图1可见，各组49日龄肉仔鸡心脏未见组织学结构变化。各组均表现为心脏被膜光滑；心肌细胞呈短柱状，排列紧密、整齐，细胞染色均匀；心肌细胞的润盘及横纹间质无炎性细胞浸润；细胞核呈圆形或椭圆形，位于肌细胞的中央。

由图2可见，各组49日龄肉仔鸡肝脏未见组织学结构变化。各组均表现为肝小叶呈多角棱柱体，结构规则；肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，界限清晰，呈均匀的网状结构；肝索和肝窦结构完整清晰。

由图3可见，各组49日龄肉仔鸡脾脏未见组织学结构变化。各组均表现为脾脏结构清晰完整，脾小结数量和直径未见变化；中央动脉直径和周围淋巴鞘厚度未见差异。

由图4可见，各组49日龄肉仔鸡肺脏未见组织学结构变化。各组肺成鲜红色，表面覆有浆膜；三级支气管上皮细胞无炎性渗出物，表面微绒毛粗细一致，分布均匀；肺房隔内淋巴细胞有形成淋巴小结；呼吸毛细管径大小均匀一致，管腔内无异物，上皮细胞表面光滑；呼吸毛细管周围毛细血管丰富。

表5　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡脏器指数的影响

数据表示5或6个重复笼(n=5或n=6)的平均值，每个重复笼2只鸡(公母各1只)。

Values represent the mean of five or six replicate cages (n=5 orn=6) with 2 chicks (one male and one female) per cage.

图1　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡心脏组织结构的影响

图2　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡肝脏组织结构的影响

图3　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡脾脏组织结构的影响

图4　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡肺脏组织结构的影响

由图5可见，各组49日龄肉仔鸡肾脏未见组织学结构变化。各组均表现为肾脏皮质部肾小球似球体，体积适中，结构正常，肾小球外有肾小囊包绕，囊腔清晰；肾小管上皮细胞结构正常，胞浆均质红染；髓质小体的集合管上皮细胞胞浆较均质。

以上结果表明，在本次试验条件下，饲粮添加PQQ·Na2的各组肉仔鸡主要脏器均未观测到其显微结构和形态的组织学结构变化。

图5　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡肾脏组织结构的影响

3　讨　论

3.1　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡生长性能的影响

研究表明，PQQ具有类维生素的作用[18]，其促生长的作用可能与增强生物体生长、发育信号转导过程中的RSA基因的表达有关[19]，是动物生长、发育和繁殖必需的营养因子。张亚男等[7]研究发现，给肉仔鸡提供氧化鸭油、新鲜鸭油和氧化鸭油加0.4 mg/kg PQQ·Na2的3种饲粮，饲粮添加PQQ·Na2有改善氧化鸭油组肉仔鸡生长性能的趋势，但无显著影响。Wang等[20]在饲粮中添加0～0.4 mg/kg PQQ·Na2，结果表明饲粮添加PQQ·Na2对肉仔鸡前、后期及全期生长性能无显著影响。Samuel等[21]在肉仔鸡饲粮中添加0～0.8 mg/kg PQQ·Na2，得出与Wang等[20]相似结果。本试验研究表明，饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡的生长性能均无显著影响，与前人的研究结果相似，说明在本试验条件下，饲粮添加PQQ·Na2对肉仔鸡的生长无不良影响。

3.2　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血液生理指标的影响

动物血液中血红蛋白含量和红细胞压积等血液常规指标可作为衡量机体健康状况的依据。本试验研究结果表明，饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血红蛋白含量及红细胞压积等血液指标均无显著影响。王丽云等[22]研究结果显示，设PQQ水平高、中、低3个剂量组，分别用含3.8、7.5、15.0 mg/kg(相当于人体推荐量300倍)受试物给小鼠灌胃给药90 d，结果与空白对照组没有显著差异，与本试验结果相似。这表明在本试验条件下，饲粮添加PQQ·Na2对肉仔鸡血液生理指标无不良影响。

3.3　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡血浆生化指标的影响

血浆总蛋白和白蛋白的含量在一定程度上可以反映机体蛋白质的合成和代谢状况。血浆中谷丙转氨酶和谷草转氨酶是反映机体肝功能的重要指标，当肝脏受到损伤时，血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性会升高；血浆中肌酸激酶活性能反映出心肌细胞受损的水平；碱性磷酸酶多存在于骨骼及肝脏中，可以将相应底物去磷酸化产生磷酸，然后与钙结合沉积于骨骼中，肝脏或成骨细胞出现损伤时，碱性磷酸酶活性会升高[23]。本试验研究结果显示，饲粮PQQ·Na2添加水平对血浆中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酸激酶、碱性磷酸酶活性及总蛋白、肌酐、总胆红素和葡萄糖含量等血浆生化指标均无显著影响，这与孙丽敏[9]和Wang等[20]研究结果相似，表明饲粮中添加PQQ·Na2对肉仔鸡血浆生化指标均无不良影响。

3.4　饲粮PQQ·Na2添加水平对49日龄肉仔鸡脏器指数的影响

免疫器官指数和消化器官指数是反映动物免疫和消化功能的重要参考指标。本试验研究结果表明，饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡免疫器官指数和消化器官指数均无显著影响。Samuel等[21]的研究结果也表明，饲粮PQQ·Na2水平不影响肉仔鸡的相关免疫器官指数(胸腺、脾脏和法氏囊)和溶菌酶活性。以上结果表明，饲粮添加PQQ·Na2不影响肉仔鸡主要内脏器官的发育。

3.5　饲粮PQQ·Na2添加水平对肉仔鸡主要脏器组织结构的影响

脏器的组织结构是反映动物机体新陈代谢的重要指标。在本试验中，肉仔鸡饲粮添加不同水平PQQ·Na2后，未观测到心脏等主要内脏器官组织显微结构和形态的组织结构变化。王丽云等[22]通过给小鼠灌服高、中、低(3.8、7.5、15.0 mg/kg)3个水平的PQQ，对照组饲喂普通饲粮，灌胃容积为10 mL/kg体重，发现小鼠脏器出现轻微变化，但未发现明显的组织结构病变。赵芹[24]的研究表明，用浓度为50～400 nmol/L PQQ·Na2处理30周龄海兰褐蛋鸡肝脏细胞，发现肝脏细胞存活率与正常对照组相比没有显著影响，表明50～400 nmol/L PQQ·Na2未能对体外培养的蛋鸡原代肝细胞产生毒性作用。这与本试验结果基本相似，表明饲粮添加PQQ·Na2不会引起肉仔鸡重要组织的结构变化。

本试验研究结果显示，饲粮添加0、0.3、1.5和3.0 mg/kg PQQ·Na2并未对肉仔鸡生长性能、血浆生化指标、血液生理指标、免疫器官及主要脏器发育造成不良影响，因此，建议肉仔鸡饲粮中PQQ·Na2的最高有效添加水平为0.3 mg/kg，具有10倍的安全系数，对肉仔鸡饲喂是安全的。有研究表明，PQQ作为一种生长因子，可激活对细胞生长、繁殖和分化有重要作用的转录蛋白和转录因子，从而引起细胞生长、分化和存活，达到促进动物体生长的目的[25]。而本试验结果表明，饲粮添加PQQ·Na2对肉仔鸡的生长性能并没有产生影响，可能因为动物品种和环境的差异引起，且动物机体存在一定的耐受性，所以在本试验的添加水平下，PQQ·Na2未能对肉仔鸡各指标产生影响。