德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中免疫和抗氧化指标以及皮肤中抗菌肽基因表达的影响

2018-07-16曾庆辉姚玉红丁翔飞史丽莎李晓凡张春暖

动物营养学报 2018年7期

曾庆辉　刘　敏　姚玉红　丁翔飞　史丽莎　李晓凡　张春暖

(河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003)

鱼类是比较低等的脊椎动物，免疫系统远不如哺乳动物及禽类完善，其免疫系统可分为体外免疫系统及体内免疫系统，皮肤是鱼类体外免疫系统的重要组成部分，鱼类皮肤上含有大量的黏液细胞、巨噬细胞和各类淋巴细胞以及其他活性物质，在鱼体表面形成了阻挡病原微生物的保护膜，是抵御病原微生物感染的有效防线[1]。鱼类皮肤黏液成分比较复杂，研究发现鱼类皮肤黏液中不仅存在免疫球蛋白[2]，而且还含有多种酶和免疫因子，包括溶菌酶(LYZ)、组织蛋白酶、酯酶、金属蛋白酶、凝集素、干扰素、钙调素、补体、抗菌肽、组蛋白和核糖体蛋白等[3]。近年来，鱼类皮肤黏膜免疫应答的分子机制是鱼类免疫学研究热点问题之一，研究鱼类皮肤免疫相关基因在机体免疫中的作用，有助于理解鱼类皮肤免疫应答的分子调控机制，为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。

乳酸菌具有增强动物机体免疫力、改善胃肠道菌群平衡、抗氧化、抗肿瘤、抗高血压和降低胆固醇含量等作用[4]。据报道，乳酸菌作为免疫增强剂能够增强巨噬细胞活性、促进动物免疫器官的发育、提高细胞的吞噬能力，并且少量的乳酸菌持续刺激能够诱导产生干扰素、促进细胞分裂、产生抗体及促进细胞免疫等，从而提高体液免疫和细胞免疫水平[5]。但是关于德氏乳酸菌在鱼类皮肤免疫和抗氧化功能方面的相关报道还不多，因此，本试验以黄河鲤作为研究对象，在饲料中添加不同水平的德氏乳酸菌进行饲喂，测定皮肤中相关免疫和抗氧化指标，为德氏乳酸菌在提高鱼类免疫上的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

德氏乳酸菌购自瑞士的Fluka公司，活菌数为1.0×1010CFU/g；黄河鲤购自洛阳市某养殖场，初始体重为(15.0±0.5) g，试验开始前驯化2周，驯化期间投喂鲤鱼商品饲料(购自洛阳禾丰饲料公司)，鲤鱼商品饲料粗蛋白质含量为33.6%，粗脂肪含量为6.62%，每天投喂3次。

1.2　试验饲料

以商品饲料作为基础饲料，基础饲料以鱼粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕为蛋白质源，豆油、鱼油为脂肪源，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加1×105、1×106、1×107和1×108CFU/g的德氏乳酸菌，配制4种试验饲料。将各种饲料原料充分粉碎后过60目筛，并逐级混合，然后把德氏乳酸菌加入适量的水，和饲料原料充分混合后用绞肉制粒机制成直径为2 mm的颗粒饲料，并在40 ℃下烘15 h，使饲料水分含量小于10%，保存在-4 ℃冰箱备用。

1.3　饲养管理

驯化结束后，选取450尾健康、规格一致的黄河鲤，随机分为5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。对照组投喂基础饲料，试验组投喂德氏乳酸菌添加量分别为1×105、1×106、1×107、1×108CFU/g的试验饲料，养殖期为8周。每天投喂3次，投喂时间分别为07:00、12:00、17:00，每日的投喂量为鱼体重的4%～5%，并根据实际采食量相应的增加或减少，养殖期间水温控制在(25.0±0.2) ℃，溶解氧浓度在(6.0±0.2) mg/L，pH 7.2±0.2，总氨氮浓度小于0.2 mg/mL。

表1　基础饲料组成及营养水平(风干基础)

每千克预混料中含有Supplied the following per kg of premix：CuSO4·5H2O 2.0 g，FeSO4·7H2O 25 g，ZnSO4·7H2O 22 g，MnSO4·4H2O 7 g，Na2SeO30.04 g，KI 0.026 g，COCl2·6H2O 0.1 g，VA 900 000 IU，VD 200 000 IU，VE 4 500 mg，VK 3 220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB52 000 mg，VB6500 mg，VB121.6 mg，VC 10 000 mg，氯化胆碱 choline chloride 60 000 mg，泛酸 pantothenate 1 000 mg，叶酸 folic acid 165 mg。

1.4　样品采集与指标测定

1.4.1样品采集

养殖试验结束后，试验鱼停食24 h，然后用MS-222(浓度为100 mg/L)对鱼进行麻醉，用干净玻片轻轻刮取皮肤黏液，收集5 mL，放入-20 ℃冰箱以备用，然后取其皮肤，将皮肤置于液态氮中冷冻1 h，然后储存在-80 ℃冰箱中，以备后续分析。

1.4.2皮肤黏液中免疫和抗氧化指标的测定

皮肤黏液中LYZ、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)活性，补体3(C3)、补体4(C4)、丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T-AOC)均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，具体操作步骤详见说明书。

1.4.3皮肤中抗菌肽基因相对表达量的测定

表2　引物信息

1.5　数据统计与分析

原始数据先用Excel 2010做简单的处理，再用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，当各组差异显著时，用Duncan氏法进行平均值间的多重比较，数据用平均值±标准误来表示，P<0.05表示显著差异。

2　结果与分析

2.1　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中免疫指标的影响

由表3可知，与对照组相比，添加德氏乳酸菌的各试验组皮肤黏液中各免疫指标均有不同程度的升高，其中1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌组的LYZ、AKP活性和C3、C4含量显著高于对照组(P<0.05)，而1×105和1×108CFU/g乳酸菌组的这些指标与对照组差异不显著(P>0.05)。皮肤黏液中ACP活性各组之间差异均不显著(P>0.05)。

2.2　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中抗氧化指标的影响

由表4可知，1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌组皮肤黏液中SOD活性显著高于对照组(P<0.05)，而其他各组之间差异不显著(P>0.05)；1×106CFU/g德氏乳酸菌组皮肤黏液中CAT和GPx活性显著高于对照组(P<0.05)，其他试验组与对照组并无显著差异(P>0.05)；1×105、1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌组皮肤黏液中T-AOC显著高于对照组(P<0.05)，其他试验组与对照组差异不显著(P>0.05)；在1×106和1×107CFU/g德氏乳酸菌组皮肤黏液中MDA含量显著低于对照组(P<0.05)，而其他试验组与对照组差异不显著(P>0.05)。

2.3　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤中抗菌肽基因表达的影响

由图1可知，各试验组皮肤中抗菌肽基因Leap-1和Leap-2的相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)，且在1×107CFU/g德氏乳酸菌组达到最高。

3　讨　论

3.1　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中免疫指标的影响

鱼类的皮肤中含有大量的黏液细胞、巨噬细胞和抗体分泌细胞，与其他活性物质组成了抵御病原微生物感染的有效防线[6]。本研究结果显示，饲料中添加不同水平的德氏乳酸菌后，黄河鲤皮肤黏液中LYZ、ACP活性和C3和C4含量随升高程度不同，但均有升高，这证明黄河鲤的免疫功能有所提高。LYZ是机体内重要的免疫因子之一，主要由一些免疫细胞分泌产生，鱼类的皮肤黏液中含有多种酶和免疫因子，这些物质对鱼类免疫反应起到重要作用。乳酸菌作为一种益生菌，能够促进有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖，一些有益菌比如乳酸菌和双歧杆菌的细胞壁含有脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖、磷壁酸复合物，它们具有很强的免疫佐剂活性作用，能够提高鱼类的免疫力[7]。潘康成等[8]报道，乳酸菌可提高水产动物免疫识别力，诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统，从而增强机体的非特异性和特异性免疫功能。关于益生菌提高鱼类血液LYZ活性的已有相关的报道[9-10]，另外皮肤中的补体在鱼类皮肤免疫应答过程中也发挥着重要作用[11]，其中C3、C4在鱼体抵抗病原入侵中发挥着重要作用，C3是所有补体激活途径的关键因子[12-13]。关于乳酸菌提高C3、C4含量在黄河鲤的血液上有相关的研究，但是在皮肤上的研究还未见报道，C3、C4能够增强免疫功能可能与其激活相关免疫通路的关键位点的关键基因有关，具体的分子机制还有待进一步研究。

表3　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中免疫指标的影响

同列数据肩标不同字母表示显著差异(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with different letter superscripts were significantly different (P<0.05). The same as below.

表4　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中抗氧化指标的影响

3.2　德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤黏液中抗氧化指标的影响

数据柱标注不同字母表示显著差异(P<0.05)。

Date columns with different letters were significantly different (P<0.05).

图1德氏乳酸菌对黄河鲤皮肤中Leap-1(A)和Leap-2相对表达量(B)的影响

Fig.1Effects ofLactobacillusdelbrueckiion relative expression levels ofLeap-1 (A) andLeap-2 (B) genes in skin ofCyprinuscarpioHuanghe var.

3.3　德氏乳酸菌对黄河鲤的皮肤中抗菌肽基因表达的影响

抗菌肽基因广泛存在于鱼类中，是鱼类先天免疫系统的重要组成部分，在抵御病原微生物入侵的过程中发挥着重要作用[18]。本试验中，添加德氏乳酸菌的各试验组黄河鲤皮肤中抗菌肽基因Leap-1和Leap-2的相对表达量均较对照组显著升高，这表明添加德氏乳酸菌提高了黄河鲤的免疫力和抗病力，这可能是由于德氏乳酸菌提高了皮肤黏液中免疫酶的活性，免疫酶在机体的免疫应答反应中起到了重要作用；另外，免疫球蛋白和一些细胞因子可以作为调节免疫的重要因素，并且乳酸菌产生的一些短链脂肪酸可以促进肠道内有益菌比如乳酸菌的增殖，抑制有害菌生长，这与免疫反应的调节都密切相关。关于乳酸菌提高鱼类免疫的研究有相似的报道[19-20]，该研究还得出过高浓度的德氏乳酸菌并不能起到较好的效果，因此，适宜的添加量对德氏乳酸菌的作用效果有直接的影响。