全混合日粮粗饲料水平对奶牛的挑食行为、瘤胃内容物及血清指标的影响

姜富贵　林雪彦　闫振贵　侯秋玲　王　云　胡志勇　王中华*

(1.山东农业大学动物科技学院，泰安 271018；2.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南 250100；3.山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

目前，大多数文献主要通过改变粗饲料的来源和粒度来研究TMR对奶牛挑食行为的影响。Leonardi等[2]研究发现，长粒度TMR增加奶牛挑食行为，而粗饲料来源对挑食行为无显著影响。其他相关研究也发现类似结果[2,4,8-11]，但Bhandari等[12]认为，TMR粒度对挑食行为没有显著影响。相比之下，国内外有关TMR中粗饲料水平对奶牛挑食行为影响的研究较少，Devries等[13]发现，饲喂低粗饲料水平(50.7%)和高粗饲料水平(62.3%)饲粮时，奶牛均挑食粒度较小的饲粮，且挑食行为在饲喂低粗饲料水平饲粮时更加严重。因产奶量不同或泌乳阶段不同，奶牛采用的饲粮精粗比不同，故有必要探究粗饲料水平对奶牛挑食行为的影响规律。本试验通过饲喂奶牛不同粗饲料水平的TMR，研究其对挑食行为、瘤胃内容物及血清指标的影响，为生产上降低奶牛挑食提供一定的参考。

1　材料与方法

1.1　试验动物

选择12头经产荷斯坦牛(其中4头安装瘤胃瘘管)，平均体重为(629±46) kg，泌乳天数为(119±26) d。试验牛单栏饲养，每天05:30和17:30进行饲喂，控制剩料量在10%以内(鲜重基础)。试验牛于每天05:00和17:00进行挤奶，全天自由饮水。

1.2　试验饲粮

试验饲粮为TMR，参照中国《奶牛饲养标准》[14]进行配制，4组饲粮的粗饲料水平分别为40%、50%、60%和70%。试验牛栏安放舔砖，以确保满足试验牛只的矿物元素需要。试验饲粮组成及营养水平见表1。

表1　试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1)预混料为每千克饲粮提供 Premix provided the following per kilogram of diets: VA 160 000 IU，VD330 000 IU，VE 300 mg，VK330 mg，P 80 mg，Mn 550 mg，Zn 750 mg，食盐 NaCl 80 mg，Ca 200 mg，Cu 400 mg，Fe 1 800 mg。

2)非纤维性碳水化合物(%)=100-(中性洗涤纤维+粗蛋白质+粗脂肪+粗灰分)。NFC(%)=100-(NDF+CP+EE+Ash).

3)依据中国《奶牛饲养标准》[14]估算。Estimated based onFeedingStandardofDairyCattleof P. R. China.

1.3　试验设计

12头试验牛随机分为4组，每组3头牛并确保每组含1头瘘管牛。试验采用4×4拉丁方设计，共4期动物试验，每期试验21 d，其中预试期13 d，采样期8 d。

1.4　测定指标及方法

1.4.1常规营养指标

样品粗蛋白质(CP)含量的测定采用凯氏定氮法；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量的测定参考Van Soest等[15]提出的方法；干物质(DM)和粗灰分(Ash)含量测定参考张丽英[16]主编的《饲料分析与饲料质量检测技术》；总能(GE)的测定采用全自动氧弹量热仪(Parr 6200，美国)；淀粉含量测定参考GB/T 20194—2006的方法。

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1.4.2奶牛挑食行为

每期试验的第14天，分别于晨饲后0、4、8和12 h收集饲粮和剩料样品，使用4层(19、8、4和<4 mm)宾州饲料颗粒分级筛(PSPS，宾夕法尼亚州立大学)测定粒度分布，于105 ℃烘箱下测定DM含量，计算分析奶牛挑食行为。

各层挑食行为=实际采食量(kg/d)/
预测采食量(kg/d)[17]；
预测采食量(kg/d)=[投料量(kg/d)×
饲粮比例(%)]/[剩料量(kg/d)×
剩料比例(%)][2]。

1.4.3瘤胃液相和固相外流速度

每期试验的第14天，参考冯仰廉[18]的方法，使用重铬酸钠和抗坏血酸制备铬标记的羊草，晨饲前，每头瘘管奶牛放入300 g标记好的羊草，分别在饲喂后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、60、72、84、96、108和120 h，直肠取粪，65 ℃烘干，粉碎通过1.0 mm筛孔。参考GB/T 13088—2006，使用分光光度法测定粪中三氧化二铬(Cr2O3)含量，将Cr2O3含量最大的粪样设置为t=0时的粪样，其Cr2O3的含量为C0，将以后各时间点时间点(t)和Cr2O3含量按公式(Ct=C0e-kt)进行最小二乘数据拟合，求出固相外流速度常数k值。

每期试验的第15天，用钴-乙二胺四乙酸(Co-EDTA)作为标记物，晨饲前，每头瘘管牛瘤胃多位点一次性投入150 mL含18 g Co-EDTA的水溶液，分别在投入后0、2、4、6、8、10、12、14、16、24、30 h，抽取50 mL瘤胃液样品，-20 ℃保存，测定时4 ℃融化，在10 000×g下离心15 min，取10 mL上清液至离心管中。参考GB/T 13884—2003，使用火焰原子吸收光谱仪测定钴(Co)含量。以0 h的瘤胃液Co含量为空白对照，将以后各时间点(t)及其相应Co含量的自然对数[ln(Ct)]按公式[ln(Ct)=kt+a]进行线性回归，回归直线的斜率k即为瘤胃液稀释率(%/h)。相应地，瘤胃液外流速度(L/h)=瘤胃液稀释率(%/h)×瘤胃液体积(L)。

1.4.4粪样粒度

每期试验的第16～17天，采集牛只新鲜粪样，使用粪便分析筛(Nasco公司，美国)进行粪便粒度分析。

1.4.5血清指标

每期试验第20天，晨饲前颈静脉采血，37 ℃水浴60 min，离心机2 720×g离心15 min，分离血清，测定血清指标。β-羟丁酸(β-OHB)含量指标采用南京建成生物科技有限公司试剂盒，胰岛素(INS)、生长激素(GH)、胰高血糖素(GCG)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)含量采用天津九鼎生物制品有限公司试剂盒，瘦素(LEP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和5-羟色胺(5-HT)含量采用上海信然试剂公司试剂盒，以上指标均使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)在酶标仪(ELx800，Bio-Tek公司，美国)上进行测定。非酯化脂肪酸(NEFA)含量采用南京建成生物工程研究所试剂盒，利用比色法在可见分光光度计(UV757CRT/PC，上海精密科学仪器有限公司)上测定。

1.4.6瘤胃内容物成分和粒度

每期试验的第21天，将全部瘤胃内容物取出，放入保温方形大塑料桶内，混合均匀后称重并取样，一部分样品使用PSPS测定粒度，另一部分置于烘箱65 ℃烘干后测定养分含量。

1.5　数据统计分析

数据使用SAS 9.1软件MIXED过程进行方差分析。所有数据以最小二乘均值呈现。各指标随粗饲料水平的直线、二次曲线和三次曲线反应使用CONTRAST语句实现。P<0.05为差异显著，0.05≤P<0.10为存在差异趋势。

2　结　果

2.1　饲粮粗饲料水平对奶牛挑食行为的影响

由表2可见，饲粮粗饲料水平为40%时，奶牛喜食粒度≥4 mm饲粮，厌食粒度<4 mm饲粮；饲粮粗饲料水平为50%、60%、70%时，奶牛厌食粒度≥4 mm饲粮，喜食粒度<4 mm饲粮。此外，随饲粮粗饲料水平增加，奶牛厌食粒度≥4 mm饲粮以及喜食粒度<4 mm饲粮的程度线性增加(P<0.05)。随投料后时间的增加，奶牛对各粒度饲粮的挑食程度逐渐降低。

表2　饲粮粗饲料水平对奶牛挑食行为的影响

1)数值=1.00表示无挑食行为，数值>1.00表示喜食，数值<1.00表示厌食。The value of 1.00 indicate no sorting, values>1.00 indicate sorting for, and values <1.00 indicate sorting against.

2)P>0.10表示影响不显著，P<0.05表示影响显著，0.05≤P<0.10表示有趋势影响。下表同。P>0.10 mean no significant effect,P<0.05 mean significant effect, 0.05≤P<0.10 mean tendency effect. The same as below.

3)L为饲粮粗饲料水平的直线反应值。下表同。L mean linear curve calculated value for dietary forage level. The same as below.

4)Q为饲粮粗饲料水平的二次曲线反应值。下表同。Q mean quadratic curve calculated value for dietary forage level. The same as below.

5)C为饲粮粗饲料水平的三次曲线反应值。下表同。C mean cubic curve calculated value for dietary forage level. The same as below.

2.2　剩料粒度分布

由图1可见，饲粮粗饲料水平对各时间点剩料粒度分布的影响主要发生在<4 mm和19 mm层。随饲喂后时间的增加，19 mm层的比例逐渐上升，<4 mm层的比例逐渐降低。

2.3　饲粮粗饲料水平对奶牛瘤胃内容物养分含量及粒度分布的影响

由表3可见，饲粮粗饲料水平对瘤胃内容物各层粒度分布无显著影响(P>0.05)。随饲粮粗饲料水平的增加，瘤胃内容物ADF含量显著线性增加(P=0.016 3)，CP含量显著线性降低(P=0.003 6)，NDF和OM含量无显著变化(P>0.05)。

2.4　饲粮粗饲料水平对奶牛瘤胃固相和液相外流速度的影响

由表4可见，随饲粮粗饲料水平的增加，瘤胃固相外流速度、瘤胃液外流速度及瘤胃液稀释率显著线性增加(P<0.05)，瘤胃内容物重量和瘤胃液体积无显著变化(P>0.05)。

2.5　饲粮粗饲料水平对奶牛粪样粒度分布的影响

由表5可见，饲粮粗饲料水平对奶牛粪样各层粒度分布无显著影响(P>0.05)。

2.6　饲粮粗饲料水平对奶牛血清指标的影响

由表6可见，随饲粮粗饲料水平的增加，血清IGF-1含量显著线性增加(P=0.001 9)，血清5-HT、β-OHB、GLP-1和GCG含量无显著变化(P>0.05)，血清LEP和NEFA含量有线性增加的趋势(P=0.060 4、P=0.080 0)，血清GH和INS含量有线性降低的趋势(P=0.074 3、P=0.096 4)。

表3　饲粮粗饲料水平对奶牛瘤胃内容物养分含量及粒度分布的影响

3　讨　论

3.1　饲粮粗饲料水平对奶牛挑食行为的影响

奶牛对TMR的挑食行为是生产上普遍关注的问题。在泌乳周期内，饲喂奶牛TMR的精粗比通常不同，因此本试验研究了饲粮粗饲料水平对奶牛挑食行为的影响，发现奶牛对不同粗饲料水平的饲粮均有不同程度的挑食。饲粮粗饲料水平为50%～70%时，奶牛喜食粒度<4 mm饲粮，厌食≥4 mm饲粮，这与Maulfair等[17]、Devries等[3]、Leonardi等[2]、Leonardi等[10]的研究结果相一致。因饲粮粒度≥4 mm的主要为粗饲料，粒度<4 mm的主要为精饲料，故以上结果表明奶牛具有喜食精饲料、厌食粗饲料的习性。此外，饲粮粗饲料水平为50%～70%时，随粗饲料水平的增加，奶牛喜食精料的程度显著线性增加，而Devries等[3]发现，饲粮粗饲料水平较低时，奶牛挑食精料的程度较大。造成结果分歧的原因可能与试验间采用的粗饲料来源不同有关，本试验采用的粗饲料为全株玉米青贮、苜蓿、燕麦和羊草，而Devries等[3]采用的粗饲料为玉米青贮和牧草青贮。此外，Leonardi等[19]发现，投料量是影响奶牛挑食程度的重要因素，而本试验严格控制剩料量在鲜重基础上10%以内。Leonardi等[20]发现，向DM水平较高(80%)的饲粮中添加水，增加饲粮湿度能够显著降低奶牛的挑食行为。值得注意的是，Leonardi等[20]增加饲粮湿度后，饲粮DM水平仍高达64%，显著高于本试验采用的饲粮DM水平(平均42.8%)。此外，本试验中各饲粮DM水平较为统一，饲粮DM可能不是本研究中影响奶牛挑食的主要因素。因此，未来研究有必要探究饲粮DM水平如何影响奶牛挑食行为。与饲粮粗饲料水平为50%～70%时的结果相反，饲粮粗饲料水平为40%时，奶牛喜食粒度≥4 mm饲粮，厌食粒度<4 mm饲粮。造成此结果的原因可能与奶牛饲喂粗饲料水平为40%饲粮时存在SARA有关，为缓解较低的瘤胃pH并维持瘤胃内环境稳定，奶牛反馈性选择以粗饲料为主的长粒度饲粮。尽管目前预示奶牛存在SARA的瘤胃pH临界值存在争议，但瘤胃pH在5.60～5.80以下常作为奶牛存在SARA的标志[21]。而本试验中，饲粮粗饲料水平为40%时，瘤胃pH<5.80的时间为7.9 h/d，显著高于其他组，详细数据见已发表文献[24]。

表4　饲粮粗饲料水平对奶牛瘤胃固相和液相外流速度的影响

表5　饲粮粗饲料水平对奶牛粪样粒度分布的影响

表6　饲粮粗饲料水平对奶牛血清指标的影响

3.2　饲粮粗饲料水平对剩料粒度分布的影响

饲粮粗饲料水平对各时间点剩料粒度分布的影响在一定程度上能够直接反映奶牛的挑食行为[17]。投料后，剩料粒度变化主要发生19 mm层和<4 mm层。随投料后时间的增加，剩料粒度≥19 mm的比例逐渐增加，粒度<4 mm的比例显著降低。该结果直观说明奶牛喜食粒度<4 mm且厌食粒度≥19 mm饲粮，进而导致粒度19 mm的剩料比例增加，粒度<4 mm的剩料比例减少。但是采用剩料粒度分布作为反映奶牛挑食行为的直观指标存在一定问题。如粗饲料水平为40%时，随投料后时间的增加，粒度≥19 mm的剩料比例逐渐增加，粒度<4 mm的剩料比例显著降低。该结果与奶牛喜食粒度≥4 mm饲粮，厌食粒度<4 mm饲粮的结果相矛盾。造成矛盾的原因可能与奶牛挑食行为受剩料量的影响有关，例如，剩料量很少的情况下，即使剩料粒度变化很大，但对奶牛挑食行为的计算值影响很小。因此，以实际采食量与预测采食量的比值作为反映奶牛挑食行为的指标更准确。

3.3　饲粮粗饲料水平对瘤胃内容物养分含量和粒度及粪样粒度的影响

粗饲料水平对瘤胃内容物养分含量、粒度以及粪样粒度影响的研究较少。本试验中，4种饲粮粗饲料水平条件下，瘤胃内容物粒度无显著差异的原因可能与采样时间点有关。内容物样品采集时间为每期试验的第21天的晨饲前，瘤胃内容物在奶牛的反刍活动下可能已被充分切短。而在瘤胃内容物养分含量方面，随粗饲料水平增加，瘤胃内容物ADF含量显著线性增加，CP含量显著线性降低，而NDF含量无显著差异。此结果可能与奶牛ADF采食量显著线性增加，CP采食量显著线性降低以及NDF采食量无显著差异有关[22]。此外，本试验中，粪样各层粒度分布不受饲粮粗饲料水平的影响，该结果需要在未来研究中进一步验证。

3.4　饲粮粗饲料水平对奶牛瘤胃固相和液相外流速度的影响

Cassida等[23]研究发现，奶牛唾液分泌量对瘤胃液外流速度起决定性作用。本试验中，瘤胃液外流速度随饲粮粗饲料水平的增加显著线性增加，但全天唾液分泌量仅数值上增加[22]，可能与试验间采用的唾液分泌量测定方法不同有关。本试验中，瘤胃内容物重量和瘤胃液体积随饲粮粗饲料水平增加呈二次曲线变化的趋势，而Maekawa等[24]研究发现有线性增加的趋势。此外，瘤胃固相外流速度随饲粮粗饲料水平增加显著线性增加，此结果与Zebeli等[25]认为粗饲料有助于增加瘤胃垫的厚度和稠度进而增加固相内容物瘤胃滞留时间的观点不一致。因此，饲粮粗饲料水平对瘤胃固相及液相外流速度的影响可能受测定方法、动物自身等因素的影响，未来研究有必要进一步进行阐明。

3.5　饲粮粗饲料水平对奶牛血清指标的影响

GH能够增强动物食欲，调节能量平衡[26]。本试验中，随饲粮粗饲料水平的增加，GH含量线性降低的趋势与奶牛采食量显著线性降低的结果[22]相一致。LEP作为一种LEP基因的编码产物，对食物摄入和能量平衡具有重要的调节作用[27]。Morton等[28]用小鼠研究LEP对短期采食量和饱感信号感应的影响，证实LEP对采食量有重要调控作用，可通过抑制下丘脑神经肽Y(NPY)的表达来抑制摄食。本试验中，血清LEP含量线性增加的趋势伴随奶牛采食量显著线性降低的结果进一步证实LEP是抑制动物采食因子。此外，本试验中，随饲粮粗饲料水平增加，血清IGF-1含量显著线性增加，血清INS含量有线性降低的趋势。而Relling等[29]在观察到采食量下降的同时，同样发现血清IGF-1含量的增加和INS含量的减少。以上结果表明，IGF-1和INS也是动物采食量的重要调控因子。相应地，奶牛采食量的变化同样影响血清指标，随饲粮粗饲料水平的增加，奶牛采食量显著线性降低，造成瘤胃内可发酵有机物减少，引起瘤胃内丙酸浓度降低[22]，进而降低肝脏糖异生和血清INS含量[30]。

4　结　论

① 饲粮粗饲料水平为40%时，奶牛喜食粒度≥4 mm饲粮，厌食粒度<4 mm饲粮，但粗饲料水平为50%～70%时，奶牛厌食粒度≥4 mm饲粮，喜食粒度<4 mm饲粮。

② 饲粮粗饲料水平不影响瘤胃内容物粒度、重量和体积，但显著影响瘤胃液相和固相的外流速度。