细胞自噬减缓PM2.5诱导的人肺腺癌细胞系H441凋亡

李春艳，王亚红，陈　婷，杨拉维，刘　刚*

(广东医科大学附属医院 1.呼吸内科；2.临床医学研究中心， 广东 湛江 524001)

大气细颗粒物(PM2.5)可诱发并加重多类肺疾病，包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)[1]。空气中PM2.5的污染浓度升高导致COPD患者的发病率和病死率增加，并且暴露的时间长短与COPD的发病进展相关[2]。然而，PM2.5导致COPD急性加重的具体机制尚不清晰。PM2.5能诱导肺上皮细胞A549发生氧化应激及自噬增加[3]。自噬在COPD发生发展过程中也有重要作用，但其在COPD病情发展过程中是作为促进因素还是一种防御机制仍存在争议[4]。因此，本研究将进一步探讨PM2.5诱导的自噬在细胞水平上对COPD发病进程中的可能作用机制。

AKT作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其介导的AKT/mTOR信号通路对自噬的调节起重要作用[5-6]。最近，前期的研究证实温石棉诱导A549细胞的自噬过程涉及AKT/mTOR和c-Jun N-末端激酶(JNK)信号通路[7]。而本研究显示，H441细胞中PM2.5通过抑制AKT活化而诱导自噬发生。3-MA抑制自噬显著增加PM2.5引起的细胞死亡，而雷帕霉素诱导自噬会减少细胞死亡。因此，阐明PM2.5诱导的肺泡上皮细胞自噬和细胞死亡之间的复杂信号关系，可为今后COPD的诊疗提供理论依据和指导。

1　材料与方法

1.1　试剂

人肺腺癌H441细胞系(中国科学院上海细胞库)；DMEM培养基和胎牛血清(Gibco公司)；四氮唑噻唑蓝(MTT，Amersco公司)；3-MA和雷帕霉素(Sigma-Aldrich公司)；锥虫蓝(Thermo-Fisher公司)；annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(联科生物技术有限公司)，TUNEL检测试剂盒(Promega公司)；所有一抗(Cell Signaling Technology公司)；羊抗兔IgG-HRP二抗和兔抗鼠IgG-HRP二抗(北京博奥森公司)。

1.2　方法

1.2.1PM2.5采样：使用QJS- 100中流量多级颗粒物切割器(锦州利诚自动化设备有限公司)采集湛江市公交站附近空气中的PM2.5，以100 L/min的采样流速连续采集48 h。将载有PM2.5样品的纤维过滤器密封后一部分于4℃暂时保存，一部分送往广州检测中心进行GC-MS检测和X-ray荧光光谱分析鉴定其成分(表1)。

表1　PM2.5中多环芳烃和金属成分检测

1.2.2细胞培养及分组处理：用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养人H441细胞。细胞分组为阴性对照组和PM2.5处理组。对于相关诱导剂和抑制剂作用的研究，将H441细胞用诱导剂或抑制剂预处理2 h，其中包括rapamycin(10 μmol/L)、3-MA(10 mmol/L)和LY294002(10 μmol/L)，在抑制剂预处理后再用PM2.5处理细胞。

1.2.3MTT检测：收集对数期的人H441细胞，以每孔5 000个细胞的数量种于96孔板中，待细胞贴壁后，不同浓度PM2.5对H441细胞作用不同时间，然后吸除培养液，加入200 μL新鲜配制的MTT溶液(0.5 g/L)，37 ℃温箱孵育4 h后，去掉MTT工作液，加入DMSO，37 ℃孵育30 min，用酶标仪测定492 nm波长的A值。

1.2.4流式检测细胞凋亡：将H441细胞1×105个/mL种于6孔板中，待细胞贴壁后进行不同浓度PM2.5暴露处理，24 h后离心收集细胞，按照annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书进行操作，流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。

1.2.5TUNEL实验检测凋亡：细胞接种于共聚焦皿，PM2.5暴露后，按照Promega TUNEL荧光检测试剂盒的产品使用说明书进行操作，激光共聚焦显微镜下观察结果并拍照。

1.2.6蛋白免疫印迹检测蛋白表达：H441细胞进行相应的处理后，4 ℃裂解细胞后，离心收集上清。通过SDS-PAGE分离每个样品的总蛋白，并转移到PVDF膜。将PVDF膜封闭，特异性一抗4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的二抗孵育，然后化学发光处理后对图片进行量化，以actin作为内参。

1.2.7锥虫蓝染色测定细胞活力：将H441细胞用3-MA或雷帕霉素预处理2 h后，进行PM2.5(100 μg/mL)暴露处理24 h，PBS洗1次，胰蛋白酶消化细胞后，离心收集细胞，取10 μL细胞悬液，用10 μL的0.25%锥虫蓝溶液对其染色，然后在光学显微镜下使用细胞计数器计数。

1.3　统计学分析

2　结果

2.1　PM2.5 暴露下H441细胞增殖能力下降

采用MTT实验分析A549细胞在PM2.5的不同浓度(0、100、150和200 μg/mL)和不同时间(0、6、12、24和48 h)的暴露下细胞的增殖能力。PM2.5处理24 h时，100、150和200 μg/mL的浓度处理下，细胞增殖活力显著下降(图1A)(P<0.001)；在PM2.5浓度为100 μg/mL处理下，细胞在12(P<0.05)、24(P<0.001)和48 h(P<0.001)时间点细胞增殖活力显著下降(图1B)。

2.2　PM2.5 诱导H441细胞发生凋亡

H441细胞在PM2.5暴露24 h后，用流式细胞仪进行凋亡检测，发现100和150 μg/mL的浓度下，细胞凋亡率明显升高(图2A)(P<0.01)；同时，在PM2.5浓度100 μg/mL暴露24 h情况下，采用TUNEL实验来分析细胞凋亡情况，发现PM2.5暴露组的TUNEL阳性细胞显著高于对照组(图2B)(P<0.05)。

2.3　免疫印迹检测PM2.5引起H441细胞发生自噬

用浓度为100 μg/mL的PM2.5处理人H441细胞，自噬分子标志物LC3Ⅱ的表达随处理时间(6、12和24 h)的增加而逐渐增加，12(P<0.05)和24 h(P<0.01)组的吸光度值显著高于对照组和6 h组(图3)。

2.4　PM2.5 通过抑制AKT 通路诱导自噬发生

PM2.5抑制了AKT蛋白的磷酸化，使得AKT通路受阻，而AKT的总蛋白表达不受影响(图4A)。用AKT抑制剂(LY294002)阻断了AKT通路，且PM2.5也抑制了AKT通路激活，最终两者都能使得LC3Ⅱ的表达升高，表明PM2.5阻断了AKT通路后诱导了自噬的发生(图4B)。

A.treated with different concentrations of PM2.5 (100, 150 and 200 μg/mL); B.treated with PM2.5 (100 μg/mL) at 6, 12, 24 and 48 hours;*P<0.05,**P<0.001 compared with control

A.flow cytometry was used to assess the cell apoptosis; B.TUNEL assay was used to assess the apoptosis and the pictures’ magnification is ×630;*P<0.05,**P<0.01 compared with control

Western blot analyzed LC3Ⅱ protein expression after treatment with 100 μg/mL PM2.5 for 0, 6, 12 and 24 h (up panel); expression of LC3B-Ⅱ was determined relative to actin and standardized to 1 in untreated cells (down panel);*P<0.05,**P<0.01 compared with control

2.5　PM2.5 暴露下诱导自噬提高H441细胞活性

PM2.5能显著诱导细胞死亡(P<0.05)，而相对于PM2.5单独处理组细胞，雷帕霉素加剧自噬组的细胞死亡率显著下降(图5A)(P<0.01)，但用3-MA阻断自噬组的细胞死亡率明显上升(图5B)(P<0.05)。

A.cells were treated with 100 μg/mL PM2.5 for variable periods (0, 6, 12 and 24 hours); AKT and P-AKT expression was assessed by Western blot analysis; B.cells were treated with 100 μg/mL PM2.5 for 24 hours following 2 hours pretreatment with AKT inhibitor LY294002 (10 μmol/L); DMSO was tested as a control; AKT, P-AKT and LC3Ⅱ expression was assessed by Western blot

图4PM2.5抑制AKT通路活化诱导H441细胞发生自噬
Fig4AKTnegativelyregulatedPM2.5-mediatedautophagyinH441cells

H441 cells were treated with 100 μg/mL PM2.5 for 24 hours following treatment with rapamycin or 3-MA for 2 hours; cell death was assessed by trypan blue staining; A.inducing autophagy by rapamycin decreases PM2.5-induced cell death; B.inhibiting autophagy by 3-MA increases PM2.5-induced cell death;*P<0.05 compared with control;#P<0.05,##P<0.01 compared with PM2.5

3　讨论

PM2.5能够诱发呼吸系统和心血管等方面的疾病，例如慢阻肺等。在慢阻肺患者的肺组织中吸烟诱导自噬相关基因的表达水平显著升高，活化自噬，促进慢阻肺的发病，但其机制不明[8- 9]。本研究以H441细胞为研究对象来深入阐明PM2.5诱导下细胞自噬与细胞毒性之间的作用机制。

细胞受到损伤或老化后，通过自噬消除一部分非必需的蛋白分子和细胞器等来维持胞内平衡或走向死亡[10- 11]。本实验结果证明，PM2.5暴露下，雷帕霉素加剧的自噬能够降低PM2.5引起的细胞凋亡；而3-MA抑制自噬发生后，细胞在PM2.5的处理下更容易走向死亡。因此，本研究认为PM2.5不仅能够诱导细胞凋亡，而PM2.5诱导的自噬会减少其对细胞的损伤。

AKT通路的激活能促进mTOR的磷酸化，抑制自噬的发生[12- 13]。在本研究中，PM2.5暴露抑制AKT通路激活，从而可以负向促进LC3Ⅱ的表达。AKT抑制剂处理进一步地促进了LC3Ⅱ富集，加剧PM2.5诱导的自噬，这说明PM2.5诱导H441细胞自噬是通过负调控AKT通路实现。

综上所述，本研究发现在H441细胞中PM2.5通过负调控AKT通路诱导自噬发生，同时自噬的发生能够减缓PM2.5的细胞毒性，因此，PM2.5暴露下诱导的细胞自噬是一种细胞的自我保护机制。本项目的研究结果进一步阐释了PM2.5诱发慢性呼吸系统疾病的发病机制，并为新药开发和临床治疗提供了理论依据。