乳酸菌发酵条件下葛根抗氧化能力研究※

刘晓莹　张　宁　郭乃菲　朱麒臻　高　阳　王　琦

（辽宁中医药大学药学院，辽宁　大连　116600）

葛根始载于《神农本草经》，列为中品，为豆科植物野葛的干燥根，是我国传统的药食两用植物。葛根中主要的功能性成分为黄酮类、三萜类和甾体类化合物[1]，其中黄酮类含量最高，具有抗氧化、抗心律失常等作用[2]。酸奶中的乳酸菌与有机酸、活性酶、抗生物质等协同对机体功能有抗氧化的作用[3]。近些年出现了一些葛根发酵类食品的研制以及最佳工艺的选择等相关方面的研究[4-5]，但具体针对葛根酸奶中抗氧化能力变化的探究较少。

1　材料与设备

1.1主要材料与试剂

1.1.1材料 纯牛奶，酸奶（嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌），均为市售；葛根粉（产地为广西）。

1.1.2试剂 甲醇，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁，二苯基苦肼基，硫酸亚铁，水杨酸，过氧化氢，硫代巴比妥酸，亚油酸，硫氰酸铵，氯化亚铁，ABTS，过硫酸钾，芦丁，无水乙醇（均为国产分析纯试剂）；甲醇、蒸馏水（色谱纯）。

1.2主要仪器与设备 UY-1500型紫外可见分光光度计（翱艺仪器（上海） 有限公司）；十万分之一天平CP225D （Made by Sartorius）；SB-5200DT超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RE-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

2　实验方法

2.1酸奶制备方法 采用实验室自制的葛根酸奶，不添加葛根粉即为空白酸奶。

2.2总黄酮的测定方法

2.2.1标准曲线制作 精密称取芦丁10 mg，溶于10 mL甲醇中，分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL于25 mL容量瓶中定容，以甲醇为空白在250 nm下测定吸光度，以芦丁含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标做出标准曲线。

2.2.2总黄酮的测定 精密称取葛根粉（80目） 0.5 g，分别加入10 mL 30%甲醇、30%乙醇、水，混匀后静置24 h，过滤，旋转蒸发至干，以甲醇为溶剂溶解定容至10 mL，取1 mL定容至25 mL，以甲醇为空白在250 nm下测定吸光度。

2.3抗氧化能力测定

2.3.1还原力测定 按文献[3]方法测定还原力。

2.3.2DPPH·清除率 按文献[8]方法测定DPPH·清除率。

2.3.3·OH清除率 按文献[9]方法测定·OH清除率。

2.3.4抗脂质过氧化能力测定 按文献[9]方法测定抗脂质过氧化能力。

2.3.5对亚油酸的抗氧化作用 按文献[10]方法测定对亚油酸的抗氧化能力。

2.3.6对ABTS自由基的清除作用 按文献[11]方法测定对ABTS自由基的清除作用。

3　结果

3.1总黄酮含量测定 使用标准曲线y=0.0302x-0.0067（R2=0.9995）测得图1各值。如图所示，葛根发酵后总黄酮含量增高，且贮藏第5 d葛根素含量最高。产生这一现象的原因可能由于微生物的生命活动，一方面有助于合成黄酮类化合物，另一方面促进葛根内成分溶出。接种时球菌占优势的酸奶产品在贮存前3 d酸度上升较快，3 d后放慢[15]。前3 d酸奶pH值降低加快，抑制酶的活性，微生物代谢减慢。故在第24 h至72 h内葛根素的含量降低但高于发酵前葛根中葛根素的含量，72 h之后葛根素含量又逐渐上升。

图1　葛根发酵前后葛根素含量变化图

3.2抗氧化能力分析

3.2.1还原力测定 在发酵期，葛根酸奶的还原力与空白酸奶的还原力相差不大，可能是发酵时间较短，差异并不明显。但在发酵期与贮藏期，葛根粉酸奶的还原力明显大于空白酸奶的还原力，结合3.1的实验结果，说明乳酸菌的发酵作用使得整个体系中还原性成分的活性有所提高。

图2　样品量为1 mL时的还原力

3.2.2DPPH·清除率测定 根据回归方程y=0.6876x+0.0512，R2=0.9998，计算清除率，如图3所示。实验结果表明，发酵期两种酸奶对DPPH·的清除率都较弱，没有太大差异，后熟期的清除率大幅升高，且空白酸奶大于葛根粉酸奶，但是相差也不大。贮藏期两者对DPPH·的清除率相差不大，并且总体上随时间增长其清除率不断下降。

图3　两种酸奶对DPPH·清除率的对比图

3.3.3·OH清除率测定 在该时期内，两种酸奶对·OH的能力都较好，且清除率差异不大，始终保持平稳状态。见图4。

图4　不同酸奶对·OH的清除率对比图

3.3.4抗脂质过氧化能力测定 实验结果表明，两种酸奶都有抗脂质过氧化的能力，且都不强，相比之下并无差异。见图5。

图5　不同酸奶抗脂质过氧化能力的对比图

3.3.5对亚油酸的抗氧化作用 两种酸奶都具有对亚油酸的抗氧化作用，且差异不大。在抑制亚油酸方面葛根对乳酸菌可能没有协同作用。见图6。

图6　不同酸奶对亚油酸清除能力的对比图

3.3.6对ABTS自由基的清除作用 实验结果表明，2种酸奶均在发酵期对ABTS自由基的清除率较大，在后熟期清除率骤降，在贮藏期第一天时又有所上升，仍然低于发酵期，之后呈曲折下降。见图7。

图7　对ABTS自由基清除率的对比图

4　讨论

乳酸菌的发酵作用对葛根中的黄酮类总量产生了影响，使其含量发生变化。葛根素的结构中连有糖基，且为碳苷，大豆苷连有糖基为氧苷，葛根素和大豆苷元结构中在4'位均是羟基，刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A结构中没有糖基，4'位均是甲氧基[13]。氧苷较碳苷易水解，更容易被微生物利用，故推测微生物可能代谢利用大豆苷，产物是刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素，使发酵前葛根中黄酮类成分有所增加。