七氟烷麻醉对大鼠海马CA3区ApoE4表达变化的影响

朱宇航，吴振宇，杨　洋，林夏妃，王　义，唐春春，朱昭琼

(1.遵义医学院附属医院　麻醉科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院，贵州 遵义 563099；3.遵义市第一人民医院，贵州 遵义 563002)

大脑海马是人类以及哺乳动物与记忆能力密切相关的组织结构，其包含齿状回、海马体(CA1～CA4区)、下托等几部分。海马体典型结构CA3区由大锥体细胞组成，主要参与空间辨别性学习记忆。人们如果出现空间记忆能力下降，轻则让人产生心理忧虑，重则会严重影响人们的日常生活和工作，并对生理健康产生极大威胁，阿尔茨海默病便是突出代表。阿尔茨海默病对记忆功能影响的研究极为广泛，学者们认为其主要病理改变是由于载脂蛋白E4基因型在脑内的过度表达所导致[1-2]，该发病机制在相关研究领域内的确切性和认同度较高。然而，记忆能力的下降是患者自身疾病所导致往往容易让其接受，但如果由于医疗过程所引发，就很难被患者及家属理解。在临床工作中医务工作者就常常遇到这样一个现象，不少患者自诉在全麻术后的相当一段时间内出现了记忆能力的下降，而全身麻醉药则被认为是“罪魁祸首”，常用吸入麻醉药七氟烷作为全麻药物家族的一份子俨然没有逃脱同样的质疑。故本研究模拟临床，将成年雄性大鼠吸入3.2%七氟烷麻醉2 h，观察苏醒后2、24、72 h逃避潜伏期和海马CA3区ApoE4蛋白表达变化，探讨七氟烷麻醉对海马CA3区ApoE4表达变化的影响。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器Morris水迷宫系统(WMT-100)购自成都泰盟科技有限公司，麻醉机(Fabius)购自德国Drager公司；气体监护仪(Vamos)购自德国Drager公司；激光共聚焦显微镜(SP2)购自德国Leica公司；七氟烷(批号：65120501) 购自山东鲁南贝特制药有限公司；ApoE4兔多抗(一抗)购自北京博奥森生物技术有限公司；FITC羊抗兔(二抗)购自北京索莱宝科技有限公司；DAPI购自美国Vector公司。

1.2实验动物SPF级健康雄性成年SD大鼠60只，体重300～400 g，15周龄，由四川成都达硕生物科技有限公司提供(许可证号：SCXK(111)2008-24)。常规分笼饲养，每笼5只。依照啮齿类动物饲养标准，干燥饲料喂食，自由饮水。环境温度26±2 ℃，湿度40%～60%，依照自然习惯变化日光灯照射。

1.3方法

1.3.1行为学测试将所有大鼠进行单次120s游泳训练，排除不会游泳大鼠，随后进行连续4 d定位航行实验。定位航行实验：在采集记录系统中将水迷宫划分为4个象限，在水迷宫池壁45°、135°、225°、315°位置设定为入水点，第2象限内摆放隐匿平台并在系统中设定平台区域，大鼠依次分别从各入水点面向池壁入水，系统记录大鼠入水后至寻找到平台时间即为逃避潜伏期，120 s未寻找到平台的，时间记录为120 s，并引导大鼠上平台休息20 s。在麻醉后2、24、72 h再次行定位航行实验，并记录逃避潜伏期。

1.3.2实验动物分组采用大鼠d4逃避潜伏期时间，按随机数字表分成两个大组：实验组Test组(简称T组，n=30)；对照组Control组(简称C组，n=30)。依麻醉苏醒后2、24、72 h 3个不同实验时间，将T组、C组各等分成3个亚组(T2组、T24组、T72组、C2组、C24组、C72组，n=10)。

1.3.3麻醉处理密闭吸入麻醉箱两侧开孔分别接麻醉机进、出气螺纹管和气体监护仪，箱底铺垫1 cm钙石灰。实验组调节氧流量1.5 L/min+空气流量2.5 L/min，开放七氟烷挥发罐行箱内气体平衡，待进、出气口七氟烷浓度达3.2%时放入大鼠，大鼠夹尾反射、翻正反射消失后，认定大鼠进入麻醉状态，开始计时，麻醉时间2 h，进行性观察大鼠口唇颜色及呼吸运动幅度；对照组大鼠吸入氧气1.5 L/min+空气2.5 L/min共2 h。麻醉完成后，取出箱内大鼠，摆放至自然环境中，待其自然苏醒。

1.3.4取材及标本制备在麻醉苏醒后2、24、72 h进行取材，1%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，剥离完整大脑组织，冰盐水迅速清洗脑组织，切除视神经以前的额叶部分、枕叶、纹状体部分，置于4%多聚甲醛溶液中浸泡24 h后以冠状面平行切面方向进行石蜡包埋。将包埋后的蜡块在切片机上平行大脑冠状面切成3 μm的切片，粘附于经多聚赖氨酸预处理的载玻片上，置于65 ℃的恒温箱内烘烤2 h。病理切片经二甲苯脱蜡两次，每次20 min。随后依次100%、95%、85%、70%、50%乙醇梯度复水，各5 min，双蒸水复水2次，每次10 min。PBS洗片3次，每次5 min。抗原修复：将PH 6.0的柠檬酸在高压锅内加热至沸腾，放入病理切片完全浸没与柠檬酸溶液下，加盖继续加热至高压锅喷汽3 min，快速放气，冷水冲洗高压锅冷却10 min，打开高压锅盖自然冷却30 min至室温，PBS冲洗3次，每次5 min，轻轻甩去标本表面PBS。每张切片以10%牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum ,BSA)10 μL涂片封闭30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滤纸擦去标本外的PBS。每张切片标本处滴加10 μL一抗(ApoE4兔多抗，以10%BSA 按1∶20稀释)，4 ℃孵育过夜，阴性对照同法滴加等量PBS。次日取出切片室温复温1 h，PBS浸泡清洗3次，每次5 min，轻轻甩去标本表面PBS。避光环境中每张切片标本处滴加10 μL荧光二抗(FITC羊抗兔，以10%BSA 按1∶8稀释)，室温下孵育2 h，PBS浸泡洗片3次，每次5 min，滤纸擦去标本外的PBS。避光环境中每张切片滴加DAPI 10 μL，盖玻片封片。

1.3.5激光共聚焦显微镜观察海马CA3区ApoE4表达将染色后的切片放于激光共聚焦倒置显微镜下，20倍物镜观察海马形态寻找目标观察区，将视野移至目标观察区域后切换为40倍物镜并转换至扫描成像，选择激发光波长488 nm扫描阴性对照片，以照阴性对照参数为基线，分别对阳性观察切片进行扫描和采集图片，用LCS Lite软件进行光密度分析，每个脑标本取5～10张切片，每张切片取5个视野计算平均值。

2　结果

在单次适应性训练中未发现不会游泳及先天愚型大鼠。麻醉过程中无大鼠发生青紫、发绀、呼吸抑制及死亡。

2.1麻醉前定位航行实验结果显示，与d1比较，d2、d3、d4差异有统计学意义(P<0.05)，d2、d3、d4间差异无统计学意义(P>0.05，见图1)。

#：与第1天比较：P<0.05。图1　大鼠麻醉前逃避潜伏期变化趋势

2.2麻醉苏醒后2、24、72 h定位航行实验逃避潜伏期结果，各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组别苏醒后2h苏醒后24h苏醒后72hT12.3±3.213.0±7.714.8±4.4C12.6±5.812.2±10.311.7±3.8

2.3经DAPI染色切片在共聚焦显微镜下见核仁清晰，定位准确，阴性对照切片在视野中无细胞显影(见图2)。

A：DAPI染色定位图像；B：阴性切片扫描图像；共聚焦10×40。图2　海马CA3区DAPI定位及阴性对照免疫荧光结果

2.4麻醉苏醒后2 h，两组大鼠海马CA3区ApoE4荧光检测图像(见图3)，T2组平均光密度为75.4±25.6，C2组平均光密度为61.9±12.9，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

A：T组苏醒后2 h图像；B：C组苏醒后2 h图像；共聚焦10×40。图3　两组大鼠苏醒后2 h海马CA3区免疫荧光结果

2.5麻醉苏醒后24 h，两组大鼠海马CA3区ApoE4荧光检测图像(见图4)，T24组平均光密度为85.3±35.5，C24组平均光密度为65.3±19.9，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

A：T组苏醒后24 h荧光扫描图像；B：C组苏醒后24 h荧光扫描图像；共聚焦10×40。图4　两组大鼠苏醒后24 h海马CA3区免疫荧光结果

2.6麻醉苏醒后72 h，两组大鼠海马CA3区E4荧光检测图像(见图5)，T72组平均光密度为85.4±24.0，C72组平均光密度为65.3±18.9，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。

A：T组苏醒后72 h荧光扫描图像；B：C组苏醒后72 h荧光扫描图像；共聚焦10×40。图5　两组大鼠苏醒后72 h海马CA3区免疫荧光结果

2.7T组苏醒后24、72 h与苏醒后2 h比较差异有统计学意义(P<0.01)，苏醒后24 h与72 h之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组不同时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)，具体(见表2)。

组别苏醒后2h苏醒后24 h苏醒后72hT 75.4±25.6#85.3±35.5#∗85.4±4.0#∗C 61.9±12.965.3±19.965.3±18.9

#：与C组比较：P<0.01；*：与苏醒后2 h比较P<0.05。

3　讨论

七氟烷是新型临床常用吸入麻醉药，但七氟烷麻醉出现可逆性认知功能障碍的报道却时有发生[3-4]。七氟烷麻醉后有可能减少海马神经元生长，引发大鼠神经毒性和认知功能障碍的发生[5]。现有研究中发现，β淀粉样蛋白的异常沉积与痴呆样改变有着密切的关系[6]。载脂蛋白E主要在肝脏和脑内合成，其包含了ApoE2、ApoE3、ApoE4三种等位基因，ApoE3最为常见，但是ApoE4更易与β淀粉样蛋白结合形成Aβ-ApoE4复合物，进而加重神经元纤维缠结的增加[7]。张雪梅等[8]认为，ApoE4可以使β淀粉样蛋白前体蛋白APP770的mRNA水平提升近9倍，有促进细胞凋亡的作用。国内外大量阿尔茨海默病的机制研究中证实，ApoE4作为β淀粉样蛋白凝集的启动子，增强了认知功能障碍发生的风险[9-10]。

由于年龄是认知功能障碍发生的高危因素，故本实验采用了生命周期中生理机能较为旺盛及稳定的成年雄性大鼠作为研究对象，同时避免了雌激素水平的干扰。在本实验中发现，成年大鼠单纯吸入3.2%(约1.3MAC)浓度的七氟烷麻醉后可使海马CA3区ApoE4表达上调，麻醉苏醒后的24h和72 h小时较苏醒后2 h增高的更为明显。本实验行为学指标中逃避潜伏期所反映的是大鼠陈述性记忆能力，基础陈述性记忆能力的形成是大鼠麻醉前一天，在七氟烷麻醉后的72 h内两组大鼠的陈述性记忆能力并无差异，由于实验中未做大鼠麻醉前后自身行为学结果对照，因此并不能说明麻醉药物的作用不影响行为学变化，这也是本研究的不足之处。并且经过七氟烷麻醉是否影响远期陈述性记忆能力，甚至是否会对老年期大鼠产生影响将是未来的研究目标。研究结果提示：七氟烷麻醉后虽未影响生理周期旺盛的成年雄性大鼠的近期陈述性记忆能力，但引发海马CA3区ApoE4表达上调仍不排除是引发术后认知功能障碍的风险因素之一，尤其是对家族遗传性ApoE4基因型高表达的患者我们更应加强关注，做好围术期合理用药选择，以规避由七氟烷麻醉而引发的术后认知功能障碍的风险。并期盼在进一步研究中去深入探讨相关机制，为更好的指导临床诊治提供理论依据。

综上所述，成年雄性大鼠经3.2%七氟烷吸入麻醉2 h后，使海马CA3区ApoE4表达持续增高至少72 h，可能是患者术后一定时间内记忆力下降的诱发机制之一。