HPLC法测定特殊医学用途婴配食品中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯

李 涛 周艳华 孙桂芳 杨 滔 尹伟成 杨庆懿

(1. 湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410111；2. 长沙环境保护职业技术学院，湖南 长沙 410004)

特殊医学用途婴儿配方食品(以下简称特医婴配食品)是指针对患有特殊紊乱、疾病或医疗状况等特殊医学状况的营养需求而设计的粉状或液态配方食品。针对不同的婴儿患病类型分为6种配方，包括无乳糖或低乳糖配方、乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解或氨基酸配方、早产/低出生体重婴儿配方、母乳营养补充剂配方、氨基酸代谢障碍配方[1]。维生素A是一类脂溶性维生素，又称视黄醇，其主要生理功能是维持正常视觉、增强机体抗感染力及维持骨骼健康[2]。维生素A在特医婴配食品中为必须营养强化成分，通过添加视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯进行营养强化[3-4]。

目前，维生素A测定主要有液相法和液相色谱串联质谱法[5-6]。现有食品安全国家标准中维生素A测定是将视黄醇酯类皂化为醇类进行分析，一般需对样品进行酶解、皂化、提取、分离、浓缩等步骤，操作极其繁琐耗时[7-8]。特医婴配食品有6种配方，经研究发现按照现有标准中皂化条件进行皂化，会出现皂化不完全、严重乳化、维生素A不能完全游离等现象，且脂溶性维生素不稳定，在此分析过程中易损耗，回收率不高，不能进行批量操作。本试验拟采用正相高效液相色谱法直接测定特殊医学用途配方食品中的视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯[9]，以期能准确测定产品中营养强化视黄醇的类别及含量，为检测特医婴配食品中维生素A提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

特医无乳糖配方奶粉(A)、特医乳蛋白部分水解配方奶粉(B)、特医乳蛋白深度水解配方奶粉(C1)/氨基酸配方奶粉(C2)、特医早产/低出生体重婴儿配方乳(D)，特医母乳营养补充剂(E)、特医氨基酸代谢障碍配方乳(F)：市售；

视黄醇棕榈酸酯标准品：纯度98.1%，德国Dr. Eherenstorfer公司；

视黄醇醋酸酯标准品：纯度98.5%，德国Dr. Eherenstorfer公司；

叔丁基甲醚、正己烷、异辛烷：色谱纯，上海安谱实验科技有限公司；

氢醌、无水乙酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

木瓜蛋白酶：酶活> 400 U/mg，合肥博美生物科技有限责任公司。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：LC-20A型，带DAD检测器，日本岛津公司；

漩涡振荡器：HMS-350型，上海珂淮仪器有限公司；

电子分析天平：BS224S型，德国赛多利斯公司；

台式冷冻离心机：X1R型，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

pH酸度计：PB-10型，德国赛多利斯公司；

电热恒温水浴锅：HWS-28型，上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的制备 称取视黄醇棕榈酸酯约25 mg(精确至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，异辛烷溶解并定容至刻度；称取视黄醇醋酸酯约25 mg(精确至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，无水乙醇溶解并定容至刻度。分别精取0.50 mL标准溶液至50 mL容量瓶中，异辛烷稀释至刻度，得10.0 μg/mL混标储备液，分别精取0.050，0.10，0.20，0.50，1.0，2.0，5.0 mL 混标储备液至10 mL容量瓶中，异辛烷稀释至刻度，得浓度为0.05～10.0 μg/mL的标准使用液。

1.2.2 供试品溶液的制备

(1) 样品称量：固体样品精确称重25 g至250 mL碘量瓶中，加入200 mL纯水(约40～45 ℃)，溶解并冷却，称重。转移5.0 g溶解后的新样品至50 mL离心管，计算样品质量(粉末当量)；液态样品精确称取5.0 g至50 mL离心管中。

(2) 酶解：800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：称取100 mg氢醌和4.0 g无水乙酸钠于100 mL容量瓶中，加纯水80 mL溶解，用盐酸溶液调节pH至5.0，加入0.2 g木瓜蛋白酶超声5 min，冷却后定容至刻度。向样品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混匀后置于(37±2) ℃水浴30 min后冷却。

(3) 提取：向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振荡15 min，加入10.0 mL异辛烷振荡提取15 min，5 000 r/min离心10 min，取异辛烷层用于高效液相色谱分析。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax NH2(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：正己烷-25%叔丁基甲醚正己烷(体积比95∶5)，等梯度洗脱；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；紫外检测器波长：325 nm。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察

取标准使用液注入液相色谱仪测定，以峰面积(Y)为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。视黄醇棕榈酸酯线性方程为：Y=286 042X-662.074 5(R2=0.999 9)，视黄醇醋酸酯线性方程为Y=309 862.3X-4 460.171(R2=0.999 9)，标准工作液浓度为0.05～10.00 μg/mL，校准曲线线性良好，线性低点是GB 5009.82—2016 中低点的1/4倍，测定范围更广。

2.2 检出限和定量限

取空白响应值的2～3倍对应浓度的混合标准溶液0.05 μg/mL，平行测定11次，根据检出限的计算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd为标准偏差，b为工作曲线斜率)，当取样量为0.5 g，异辛烷体积为10.0 mL时，方法检出限和定量限见表1。此方法的检出限与定量限是GB 5009.82—2016 的1/3，说明此检验方法具有更高的灵敏度。

2.3 样品含量测定和精密度试验

特医婴配食品A～F分别平行取样6组，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进液相色谱测定，特医婴配食品A～F号中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯含量及精密度结果见表2、3。结果显示特医婴配食品中通常添加一种视黄醇酯类作为维生素A来源，且添加量依据适用对象的差异而不同，各配方中视黄醇棕榈酸酯含量为0.0～817.0 μg/100 g，精密度为0.9%～9.4%；视黄醇醋酸酯含量为0.0～8 683.0 μg/100 g，视黄醇醋酸酯精密度为3.3%～6.3%，精密度均满足测定要求。

表1 检出限和定量限Table 1 Detection limit and limit of quantification

表2 特医婴配食品中视黄醇棕榈酸酯含量及精密度Table 2 Content and precision of retinol palmitate in formulas for special medical purposes intended for infants

表3 特医婴配食品中视黄醇醋酸酯含量及精密度Table 3 Content and precision of retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

2.4 加标回收率试验

选取深度水解配方奶粉(C1)为代表进行特医婴配食品回收率试验，共9份，每个浓度3份，分别添加约0.5，1.0，2.0倍样品检测浓度的混合标准溶液，低中高3个加标浓度添加量分别为3.0，6.0，10.0 μg。按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进液相色谱仪测定。视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯加标回收率见表4。由表4可知，视黄醇棕榈酸酯的不同添加浓度下回收率为82.6%～90.0%，RSD值为1.8%～2.5%，视黄醇醋酸酯不同添加浓度下回收率为81.0%～88.6%，RSD值为2.2%～4.5%，深度水解配方奶粉为特医婴配奶粉中最复杂基质之一，说明该方法对特医婴配食品中不同浓度视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯的测定具有较高的准确度。

表4 样品加标回收率Table 4 Results of recovery for spiked samples

2.5 检验方法的选择性

视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯的标准溶液图谱见图1，7种特医婴配食品中视黄醇酯图谱见图2，检验方法系统性评价参数结果见表5。由图1可知，视黄醇棕榈酸酯保留时间为3.5 min，视黄醇醋酸酯保留时间为6.0 min，样品测定过程中2种视黄醇酯均未发生明显漂移，该检验方法能准确定性。由表5可知，混合标准溶液及样品中2种视黄醇酯的分离度均>1.8，高于R≥1.5的一般要求，理论塔板数均大于8 000，高于t≥3 000的一般要求，表明该检验方法将待测成分与其它杂质进行了基线分离，分离效能良好，说明该检验方法具有良好的系统适用性。特医婴配食品成分极其复杂，但样品基质不会干扰视黄醇酯分离，表明该检验方法对特殊医学用途婴幼儿食品中2种视黄醇酯具有良好选择性，分离度高。

图1 标准溶液中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯Figure 1 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in standard solution

图2 特医婴配食品中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯

Figure 2 Chromatogram of retinol palmitate and retinol acetate in formulas for special medical purposes intended for infants

表5 检验方法系统性评价参数结果Table 5 Results of method systematic evaluation parameter

3 结论

本试验建立了正相高效液相色谱测定特殊医学用途婴儿配方食品中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯的方法。采用木瓜蛋白酶酶解拥有脂肪胶束涂层的亲水性蛋白，释放视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯，酸化甲醇沉淀蛋白质，异辛烷提取，氨基柱正相分离，紫外检测2种视黄醇酯。在0.05～10.0 μg/mL时呈线性相关(R2=0.999 9)，视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯检出限分别为2.0，2.5 μg/100 g，不同添加浓度回收率为81.0%～90.0%，也可通过公式(维生素A=视黄醇棕榈酸酯×0.55+视黄醇醋酸酯×0.87)换算得到特医婴配食品中维生素A含量，此试验的线性范围和检出限均优于现有食品安全国家标准GB 5009.82—2016。

前期试验研究表明现有国标测定特医婴配食品中视黄醇时，多种配方产品皂化时会出现乳化现象严重、皂化不完全和精密差等问题。本试验方法无需将视黄醇酯皂化为视黄醇，采用直接测定样品中视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯，避开操作繁杂的皂化过程，流程简单，精密度和准确度高，可实现批量检测。此试验建立的检测方法简单、快速、准确，针对特医婴配产品中的视黄醇棕榈酸酯和视黄醇醋酸酯检测重复性好。此试验前处理酶解液还可用于测定α生育酚醋酸酯和α生育酚，后续将对此进一步研究。