实验性家兔颈动脉粥样硬化模型中颈动脉I/M值与肾动脉粥样硬化的相关性研究

陈徐亮　周野　杨鹏麟

[摘要] 目的 分析實验性家兔颈动脉粥样硬化模型中颈动脉内膜/中膜（I/M）比值变化与肾动脉粥样硬化的相关性。 方法 将48只家兔以随机数字表法分为空白组、对照组、模型组，各16只。空白组不给予任何干预，维持喂饲基础饲料；对照组给予高脂饲料120 g/d；模型组给予高脂饲料饲养7 d后，于禁食（不禁水）12 h后实施颈动脉内膜空气干燥术使其成为双侧颈动脉粥样硬化模型。获取所有家兔双侧手术段颈动脉、肾动脉标本，常规石蜡包埋、切片、HE染色后分析I/M值，并在实验结束时测定血清三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、C反应蛋白（CRP）水平，分析尿微量白蛋白/尿肌酐（UACR）比值，并进行相关性分析。 结果 空白组家兔颈动脉、肾动脉光镜下HE染色正常；对照组颈动脉可见轻微内膜增生，肾动脉仅可见轻度增生狭窄，但无明显脂质沉积；模型组颈动脉内膜明显增生增厚，内膜下大量泡沫细胞堆积，肾动脉内膜广泛显著增生，血管内径严重狭窄，高倍镜下可见增厚内膜为泡沫细胞堆积。与空白组比较，对照组和模型组家兔颈动脉、肾动脉I/M值均明显升高，血清TG、TC、CRP及UACR均明显升高，且模型组家兔颈动脉、肾动脉I/M值及血清TG、TC、CRP、UACR均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。家兔颈动脉粥样硬化模型颈动脉I/M值与肾动脉I/M值、CRP、UACR呈正相关（P < 0.05），与TG、TC相关性不明显（P > 0.05）。 结论 颈动脉粥样硬化可促进肾动脉粥样硬化发生，可能与机体炎性反应、血管内皮细胞损伤、肾脏血管病变等有关。

[关键词] 家兔；颈动脉粥样硬化；内膜/中膜比值；肾动脉粥样硬化；相关性

[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（b）-0012-05

Study on the correlation between the carotid I/M ratio and renal atherosclerosis in experimental rabbit carotid atherosclerosis models

CHEN Xuliang ZHOU Ye YANG Penglin

Department of Cardiovascular Medicine， the Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the change in carotid intima / media membrane （I/M） ratio and renal atherosclerosis in experimental rabbit carotid atherosclerosis models. Methods Forty-eight rabbits were randomly divided into the blank group， the control group and the model group by the random number table method， with 16 rabbits in each group. The blank group was not given any intervention， which was given basal feed. The control group was given high-fat diet of 120 g/d. The model group was given 7 d of high-fat diet and then the rabbits were changed into bilateral carotid atherosclerosis models through carotid intima air drying after 12 h of fasting （without fasting water）. The bilateral operative carotid arteries and renal artery specimens of all rabbits were obtained to analyze the I/M ratio after routine paraffin embedding， sectioning and HE staining. Serum levels of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and C-reactive protein （CRP） were determined at the end of the experiment. Urinary microalbumin / urine creatinine （UACR） was analyzed and correlation analysis was performed. Results HE staining under light microscope was normal in the carotid artery and renal artery of rabbits in the blank group. In the control group， there was slight intimal hyperplasia in the carotid artery and slight hyperplasia and stenosis in the renal artery， without obvious lipid deposition. In the model group， there was obviously proliferated and thickened carotid intima， a large number of foam cells accumulated in the intima， extensively proliferated intima of the renal artery and seriously narrowed vessels， and thickened intima was accumulated foam cells at high magnification. Compared with the blank group， the carotid artery， renal artery I/M ratio in the control group and model group were significantly increased， serum TG， TC， CRP and UACR were significantly increased， and the carotid artery， renal artery I/M ratio and serum TG， TC， CRP and UACR in the model group were significantly higher than those of control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The I/M ratio of carotid artery in rabbit carotid atherosclerosis models was positively correlated with the I/M ratio of renal artery， CRP and UACR （P < 0.05）， but there was no significant correlation with TG or TC （P > 0.05）. Conclusion Carotid atherosclerosis can promote the occurrence of renal atherosclerosis， which may be related to inflammatory reactions， vascular endothelial cell injury and renal vascular diseases.

[Key words] Rabbit； Carotid atherosclerosis； Intima / media membrane ratio； Renal atherosclerosis； Correlation

动脉粥样硬化一般指某些部位内膜下脂质沉积（伴平滑肌细胞增殖、纤维基质成分增加）引起的管壁增厚、变硬及管腔狭窄病变[1]，其主要累及全身主动脉、颈动脉、脑动脉、肾动脉等大中型弹力动脉、肌弹力动脉，是导致临床多种心血管疾病（脑梗死、冠心病等）发生的独立危险因素[2]。其中颈动脉作为粥样硬化最常见病变部位之一，近年来临床发生率居高不下。因其处于浅表位置，易被B超、CT、MRI等检查发现并确诊。国内外已有学者[3-5]针对颈动脉粥样硬化与全身其他部位血管如主动脉、脑动脉、冠状动脉、股动脉等的粥样硬化之间的关系展开相关研究，并证实颈动脉粥样硬化与全身动脉粥样硬化几乎都有一定的相关性，但其仍處于初步研究阶段，动物实验相对不足，尤其是其与肾动脉内膜/中膜（intima/media membrane，I/M）关系的文献报道相对较少。为此，本研究采用颈动脉空气干燥法制作家兔颈动脉粥样硬化模型，对比分析不同模型家兔颈、肾动脉I/M比值及其他生化指标，并分析颈、肾动脉I/M的相关性，以期进一步充实临床实验，并为动脉粥样硬化的临床研究与防治提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取48只SPF级雄性日本大耳白兔（JW兔，温州医科大学实验动物中心提供，合格证号：0035204），体重2.0～2.5 kg，平均（2.20±0.14）kg，均为4月龄，一般状态良好，皮毛光泽，进食与活动正常，均于实验室适应性喂养7 d，适应性喂养的条件以青菜、植物根茎叶等青粗饲料喂养，温度10～15℃，湿度65%～80%。动物的使用经温州医科大学附属第二医院伦理委员会审核通过。

1.2 主要试剂及仪器

总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）（化学纯）购自上海博光生物科技有限公司，批号为080102、081108；C反应蛋白（CRP）测定试剂盒购自杭州伊利康生物公司，批号为031008；HE染色试剂来源于温州医科大学附属第二医院病理科，批号为090812；AngⅡ放免检测试剂盒购自北京原子高科股份有限公司，批号为110205。仪器包括Olympus PM10-SP-35光学显微镜、LD4-2A台式离心机、罗氏Modular全自动生化分析仪、LumiStation-1500L型单管阵列式化学发光仪。

1.3 方法

1.3.1 分组方法 将48只家兔以随机数字表法分为空白组、对照组、模型组三组，各16只。空白组不给予任何干预，维持喂饲基础饲料。对照组给予高脂饲料120 g/d，连续喂饲10周，饮水不限；高脂饲料配方由87%基础饲料、2%胆固醇、8%猪油及2%蛋黄粉组成。模型组在给予高脂饲料喂养的基础上加颈动脉内膜空气干燥术造成家兔双侧颈动脉粥样硬化模型。

1.3.2 家兔双侧颈动脉粥样硬化模型建立方法 参考文献[6-7]实施颈动脉内膜空气干燥术，模型组家兔给予高脂饲料饲养7 d后，于术前12 h时给予禁食（不禁水），先给予3%戊巴比妥静脉麻醉和常规颈部脱毛消毒；然后自颈部正中作切口，钝性分离，使两侧颈总动脉暴露良好，钝性分离右侧颈总动脉至颈总动脉分叉前1 cm处（长约2 cm），两侧分别以动脉夹临时夹闭。接下来以皮试针头（皮试针头连接抽有生理盐水的注射器）平行于血管纵轴方向穿刺进入以阻断血管，注入生理盐水灌洗血管腔，其次以皮试针头向夹闭段的颈总动脉行空气干燥术，150 mL/min干燥10 min，干燥后重新注入生理盐水，拔出皮试针头并松开动脉夹，恢复颈总动脉的血流，给予常规止血轻压；最后以上述方法对左侧颈动脉实施空气干燥术，完成后给予青霉素局部抗感染，缝合切口，建模完成。以内皮细胞功能障碍及变性、内膜明显增生为造模成功。见图1。

1.4 病理标本获取

三组家兔均放血处死，获取双侧手术段（空白度、对照组以模型组对应位置为参考）颈动脉各0.5 cm，距两侧肾动脉起始处约0.5 cm各取1段0.3 cm长的肾动脉，生理盐水冲洗后置于4%的多聚甲醛中固定24 h（4℃，pH 7.4），石蜡包埋后切片（厚度4 μm），常规HE染色。

1.5 肾动脉I/M值测定

将HE染色处理后的病理标本通过Image pro plus 6.0软件分析I/M值。颈动脉、肾动脉每个切面在显微镜下均任意取10个视野测I/M值后取平均数表示该切面的颈动脉、肾动脉I/M值，再次取左右两侧I/M值的平均数作为此家兔最终的颈动脉、肾动脉I/M值。

1.6 生化指标测定

三组家兔均在实验结束时（第10周末，但在处死前）经耳缘静脉采血2 mL，3000 r/min离心处理5 min（离心半径15 cm），采用全自动生化分析仪测定血清TG、TC水平，以酶联免疫吸附法测定CRP水平。同时，取家兔禁食8 h后尿液，采用化学发光仪和酶促化学发光法检测尿微量白蛋白、尿肌酐水平，分析尿微量白蛋白/尿肌酐（UACR）。

1.7 统计学方法

研究数据选用统计学软件SPSS 19.0分析和处理，计量资料采取均数±标准差（x±s）表示，组间颈动脉、肾动脉I/M值、血脂水平、CRP、UACR等对比进行t、F检验；采用Pearson相关系数来评价家兔颈动脉粥样硬化模型颈动脉I/M值与肾动脉I/M值、血脂水平、CRP、UACR的关系；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理及颈动脉、肾动脉I/M值结果

空白组家兔颈动脉、肾动脉单层内皮细胞完整，中层平滑肌细胞排列整齐，内膜光滑；对照组颈动脉可见轻微内膜增生，肾动脉仅可见轻度增生狭窄，但无明显脂质沉积；模型组颈动脉内膜明显增生增厚，内膜下大量泡沫细胞堆积，肾动脉内膜广泛显著增生，血管内径严重狭窄，高倍镜下可见增厚内膜泡沫细胞堆积。见图2。与空白组比较，对照组和模型组家兔颈动脉、肾动脉I/M值均明显升高，且模型组家兔颈动脉、肾动脉I/M值均明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 生化指标测定结果

实验结束时，与空白组比较，对照组和模型组家兔血清TG、TC、CRP及UACR均明显升高，且模型组家兔血清TG、TC、CRP及UACR明显高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 相关性分析结果

家兔颈动脉粥样硬化模型颈动脉I/M值与肾动脉I/M值、CRP、UACR呈正相关（r = 0.36、0.44、0.69，均P < 0.05），与TG、TC无明显相关性（r = 0.28、0.25， 均P > 0.05）。

3 讨论

颈动脉粥样硬化是全身动脉粥样硬化的主要表现之一，其发生的影响因素包括高龄、脂质、血糖代谢紊乱、神经体液调节异常、血流动力学变异等，是导致冠心病的主要病因[8-9]。肾脏在机体的几个重要的脏器中比较独特，对灌注压减少過程中缺氧的组织具有保护作用，而肾动脉粥样硬化可导致肾动脉狭窄甚至完全闭塞，累及肾动脉开口及近段，并呈进行性加重，最终引起肾血管性高血压、肾功能损害甚至终末期肾病或肾功能衰竭[10]。故近几年来对于动脉粥样硬化的发病机制及防治策略的研究和探讨一直是国内外医学界的热门话题，而目前关于颈动脉粥样硬化与肾动脉粥样硬化的关系报道极为少见，国内仅有少量报道，如张若青等[11]的报道明确指出，颈动脉与冠脉、肾动脉粥样硬化之间存在共同的危险因素；周叶等[12]的研究结果显示颈动脉粥样硬化预测肾动脉狭窄的灵敏度较高，特异度偏低。而国外早期就有学者[13]分析指出，颈动脉、肾动脉粥样硬化之间存在共同的危险因素，如血脂代谢异常、内皮血管损伤等；Hoke等[14]证实无症状颈动脉粥样硬化患者的肾功能与正常人相比存在损伤，且可导致患者远期死亡率增加；而Geraci等[15]的近期研究明确证实高血压颈动脉粥样硬化与肾动脉粥样硬化关系密切，主要体现在其明显影响患者的脉压及肾脏血流动力学。

在以往研究基础上，为进一步明确二者的关系，本研究将48只家兔随机分为空白组、对照组、模型组，各16只，空白组不给予任何干预，对照组给予高脂饲料，模型组在给予高脂饲料基础上加颈动脉内膜空气干燥术造成双侧颈动脉粥样硬化模型。分析结果显示，空白组家兔颈动脉、肾动脉光镜下HE染色正常，对照组颈动脉可见轻微内膜增生，肾动脉仅可见轻度增生狭窄，但无明显脂质沉积；模型组颈动脉内膜明显增生增厚，内膜下大量泡沫细胞堆积，肾动脉内膜广泛显著增生，血管内径严重狭窄，高倍镜下可见增厚内膜为泡沫细胞堆积。提示颈动脉粥样硬化模型组家兔除了颈动脉发生病理变化外，肾动脉亦出现内膜增生、内径狭窄等病变。同时，空白组、对照组、模型组家兔颈动脉I/M值、肾动脉I/M值依次明显升高，提示颈动脉、肾动脉粥样硬化存在一定关系。为进一步证实这一观点，本研究在实验结束时检测三组血清TG、TC、CRP及UACR，发现与空白组、对照组相比，模型组家兔血清TG、TC、CRP及UACR明显升高，其中TG、TC为血脂指标，可反映家兔经过10周喂饲后血脂代谢情况；CRP为非特异性的炎症标志物，大量临床研究证实其在动脉粥样硬化病灶和血清中都有明显升高[16-19]，宋筱靓等[20]认为，CRP与动脉粥样硬化的存在和严重性有明显相关性，其水平的下降从某种程度上能反映抗动脉粥样硬化的效果。而UACR除了可反映肾脏血管早期病变以外，还可用于评估全身血管内皮细胞损伤情况，而肾动脉粥样硬化患者长期处于肾动脉狭窄状态下易导致血管内皮细胞功能损伤，内皮细胞表面受体结合促使血管内皮通透性增加，导致血管舒张功能降低，血管壁结构、功能受损[21-23]。经过相关性分析，本研究发现家兔颈动脉粥样硬化模型颈动脉I/M值与肾动脉I/M值、CRP、UACR呈正相关，与TG、TC相关性不明显，推断颈动脉粥样硬化可能促使机体发生炎性反应，加速血管内皮细胞损伤，诱发肾脏血管病变，从而导致肾动脉粥样硬化的发生风险增高。此外，本研究中颈动脉I/M值与TG、TC水平相关性不明显，主要与对照组、模型组喂饲相同有关，但并不排除血脂异常对肾动脉粥样硬化的发生无影响。

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（收稿日期：2017-12-21 本文編辑：张瑜杰）