丹参酮ⅡA对万古霉素损伤HK—2细胞凋亡的影响及其机制的研究

席加喜　张华君　陈晓宇

[摘要] 目的 觀察丹参酮ⅡA（TSⅡA）对万古霉素（VAN）损伤的人肾小管上皮细胞（HK-2）细胞凋亡的影响，探讨其可能机制。 方法 体外传代培养HK-2细胞，常规培养至细胞数约为1×106个/mL，分为空白组、VAN组、TSⅡAL组、TSⅡAM组、TSⅡAH组，除空白组加入PBS溶液外，其他各组加入终浓度为100 μg/L VAN建立VAN损伤HK-2细胞模型，培养24 h后，空白组、模型组加入等体积的PBS溶液，TSⅡ-A各剂量组分别加入不同浓度的TSⅡA，继续培养24 h。MTT法测定细胞存活率，比色法测定细胞悬液中乳酸脱氢酶（LDH）、过氧化氢酶（CAT）活性；荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内ROS含量，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。 结果 与空白组比较，VAN组细胞存活率、CAT活性显著降低，LDH活性和细胞内ROS水平显著升高，细胞凋亡率明显增加（P < 0.05）；与VAN组比较，TSⅡAL组、TSⅡAM组、TSⅡAH组的细胞存活率、CAT活性显著升高，LDH活性和细胞内ROS水平显著降低，细胞凋亡率明显减少（P < 0.05），且作用均有浓度依赖性。 结论 TSⅡA磺酸钠注射液能显著提高VAN损伤HK-2细胞的存活率，减少VAN损伤的HK-2细胞的凋亡，其机制可能与降低VAN损伤HK-2细胞LDH水平和细胞内的ROS水平及升高CAT等氧化应激反应有关。

[关键词] 万古霉素；丹参酮ⅡA；细胞凋亡；机制；HK-2细胞

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）04（b）-0008-04

Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 apoptosis induced by Vancomycin and the probable mechanism

XI Jiaxi ZHANG Huajun CHEN Xiaoyu

Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530021， China

[Abstract] Objective To explore the effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Injection against HK-2 cell damage induced by Vancomycin and the probable mechanism. Methods HK-2 cells were cultured in vitro till the number was up to 1×106 /mL， randomly divided into five groups： control group， VAN group， low dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， middle dose group of TSⅡA Sulfonate Injection， hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection. Except for the control group adding PBS， other groups were added 100 μg/L VAN for 24 hours. Then， the control group and VAN group were respectively added to the same volume of PBS， and the high dose group， middle dose group and low dose group of TSⅡA respectively added to different concentrations of TSⅡA. The cell viability was detected with MTT method， the activity of LDH were measured and the cell viability was detected with the content of LDH. DCFH-DA was used as the fluorescence probe to detect the level of ROS by a fluorescence microplate reader. Annexin V-FITC/PI double dyeing method was used to detect apoptosis rate. Results Compared with the control group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were decreased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were increased in the VAN group （P < 0.05）. Compared with the VAN group， the survival rate of the cells and the activity of CAT were increased， meanwhile the level of ROS， the activity of LDH and apoptosis rate were decreased in the low， middle and hight dose group of TSⅡA Sulfonate Injection （P < 0.05）， and there was a concentration dependence. Conclusion TSⅡA Sulfonate Injection can promote the proliferation of HK-2 cells in vitro， and improve the biochemical parameters and enzyme levels. The results suggest that TSⅡA Sulfonate Injection has a protective effect on HK-2 cell， and the protective mechanisms may be related with its antioxidant effect.

[Key words] Vancomycin； TanshinoneⅡA； Cell apoptosis； Mechanism； HK-2 cell

万古霉素（Vancomycin，VAN）是一种糖肽类抗生素，通过阻碍细菌细胞壁的合成而具有强大的抗菌作用，是治疗革兰阳性菌感染的主要药物，临床主要用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染[1-2]。该药具有一定的肾毒性、耳毒性，个体差异较大，且治疗指数小[3-4]，肾毒性是其剂量限值性毒性，目前临床多采用调整给药剂量和监测血药浓度的方法来减少VAN肾损害[5]，但即使严格按照肌酐清除率给药和监测血药浓度，仍有很多患者发生肾功能损伤，并不能使每一位患者获益。丹参酮Ⅱ-A（tanshinon Ⅱ-A，TSⅡA）是唇形科植物丹参的脂溶性主要有效成分之一[6]，其具有抗炎抑菌[7]、清除自由基与抗氧化作用[8]、保肝及改善肝功能、抗癌、改善血循环等药理作用[9]，研究表明，其对各种类型的急慢性肾衰竭具有保护作用[10-12]。本研究拟以HK-2细胞为研究模型，研究丹参酮ⅡA对VAN损伤的HK-2氧化指标和细胞凋亡的影响，并探讨其可能机制，以确定TSⅡA对VAN肾损伤的疗效，为开发TSⅡA新的药理作用及临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

721型分光光度计（上海分析仪器总厂）；2323-2型水套式二氧化碳培养箱（美国Shellab公司），EPICS X2型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），BIORAD550型酶联免疫测定仪（美国BIO-RAD公司）。

1.2 药品与试剂

注射用万古霉素（礼来苏州制药有限公司，批号：C467438，规格：每支500 mg）；TSⅡA磺酸钠注射液（上海第一生化药业有限公司，批号：1503022，规格：10 mg/5 mL）；细胞培养新生小牛血清（美国Hyclone公司，批号：DQAO194），DMEM培养基（美国Hyclone公司，批号：1177845）；四甲基偶氮唑蓝MTT（美国Sigma公司，批号：M2128）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物）；DCFH.DAROS检测试剂盒（杭州碧云天公司。批号：20160802）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20160723）。

1.3 HK-2细胞培养

人肾小管上皮（HK-2）细胞由广西医科大学中心实验室提供，培养条件：5% CO2培养箱，pH 7.4，37℃，10%新生牛血清，DMEM培养液。根据生長状况每2～3天消化换液传代培养，取处于对数生长期的细胞用于实验研究。

1.4 实验分组

取上述培养的处于对数期的HK-2细胞（细胞数约为1×106个/mL），接种于6孔培养板，分为空白组、VAN组、TSⅡAL组、TSⅡAM组、TSⅡAH组，除空白组外其他各组均加入含终浓度为100 μg/L VAN培养液制造VAN损伤模型，培养24 h后，空白组和模型组加入20 μl的PBS溶液，TSⅡAL组、TSⅡAM组、TSⅡAH组分别加入15、30、60 μg/mL的TSⅡA 20 μL继续培养。每组设6个复孔。

1.5显微镜下观察细胞形态学变化

按上述“1.4”方法继续处理48 h后，弃上层培养液，PBS冲洗3～5次，加入正常培养液约10 mL，光学显微镜观察细胞轮廓形态。

1.6 MTT法测定细胞存活率

按上述“1.4”方法继续处理24 h及48 h，按MTT法操作流程和步骤测定细胞存活率。紫外分光光度计下测定吸光度（A）值，检测条件为：检测波长490 nm，参比波长630 nm，结果以存活率表示，计算公式为存活率=（A实验组/A空白组）×100%。每次实验平行监测2块板，重复3次[13-14]。

1.7 比色法测定细胞悬液中的LDH、CAT活性

按上述“1.4”方法分组和处理24 h，加细胞裂解液裂解，3000 r/min离心10 min（离心半径为60 cm），弃上清液，按试剂盒测LDH、CAT含量。LDH、CAT活性均采用比色法，每次实验平行检测2块板，重复3次。

1.8 荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内ROS含量

按上述“1.4”方法分组，置于培养箱中培养24 h，参照ROS剂盒说明书，装载DCFH-DA探针，培养箱中培养20 min后予PBS缓冲液洗涤细胞5次，除尽游离的DCFH-DA，多功能酶标仪检测细胞内ROS含量，检测条件：激发波长488 nm，发射波长525 nm。结果以比值表示，计算公式为ROS含量比值=实验组A值/空白组A值[13-14]。每次实验平行监测2块板，重复3次。

1.9 Annexin V- FITC/PI双染法检测细胞凋亡率

按上述“1.4”方法分组处理48 h，经胰酶消化后离心，并以PBS 3～5次清洗重悬，去除培养基。按照细胞凋亡实验操作，在Binding Buffer悬浮细胞后加入5 μL Annexin-FITC振动30 s混匀，加入5 μL PI室温避光条件下反应15 min，取反应液上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.10 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSⅡA对VAN损伤HK-2细胞形态学的影响

实验结果显示，高倍光学显微镜下，空白组细胞形态为不规则的岛屿状，细胞布满整个板区，可见梭状细胞融合成片，并见多处复层生长：VAN组细胞明显萎缩，成不规则状，镜下细胞数量明显减少；TSⅡAL、TSⅡAM、TSⅡAH组细胞数量均有不同程度增加，但仍明显少于空白组。见图1（封四）。

2.2 TSⅡA对VAN损伤HK-2细胞存活率的影响

存活率实验显示，VAN造模处理后，HK-2细胞存活率均显著降低，且随着时间延长存活率进一步降低，且具有时间效应，差异有统计学意义（P < 0.05）；与VAN组比较，TSⅡA各组细胞存活率均出现不同程度的升高，TSⅡA L、TSⅡA M、TSⅡA H剂量组随着TSⅡA浓度的增加，存活率逐渐增加，具有一定浓度效应，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 TSⅡA对VAN损伤HK-2细胞悬液中LDH、CAT活性的影响

实验结果显示，VAN损伤后，各组LDH活性均显著增高，CAT活性均显著降低，VAN组LDH活性比空白组高出近4倍，CAT活性比空白组降低近1/2，差异有统计学意义（P < 0.05）。给予TSⅡA干预后，TSⅡA各剂量组LDH均有不同程度降低，CAT有不同程度升高，改善程度具有浓度效应，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.4 TSⅡA对VAN损伤HK-2细胞内ROS水平的影响

实验结果显示，与空白组比较，VAN组细胞内ROS水平显著升高，且数值上升近2倍，差异有统计学意义（P < 0.05）。与VAN组比较，TSⅡA各剂量组细胞内ROS水平出现不同程度下降，且随着TSⅡA浓度的增加，下降作用更明显，表现出一定的浓度效应，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.5 TSⅡA对VAN损伤HK-2细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI双染结果显示，VAN作用于HK-2细胞48 h后，细胞的凋亡率为89.6%，较空白组明显增加，TSⅡAL组、TSⅡAM组、TSⅡAH组分别为79.3%，65.6%，58.1%，较模型组显著降低（P < 0.05），且具有浓度效应。见图3。

3 讨论

研究发现，VAN进入体内后，可导致体内生成过多的活性氧自由基，氧自由基是细胞膜脂质过氧化、蛋白质变性甚至是DNA损伤的重要原因，最终通过一系列的反应导致肾脏细胞损伤[15-16]。故此，研究者进一步深入研究了一些具有抗氧化作用的药物对VAN肾损伤的保护作用。Ocak等[17]研究发现在维生素E、维生素C、N-乙酰半胱氨酸、咖啡酸苯乙酯联用VAN治疗过程中，维生素E对VAN肾毒性的保护效应最强。研究表明，丹参酮ⅡA能有效抑制细胞内过氧化产物对DNA的损伤，其保护作用可能是通过清除细胞内氧自由基，从而阻断脂质过氧化的链式反应，进而抑制DNA加成物的生成以减少細胞毒性[18-20]。

本研究结果显示，TSⅡA能有效地增加VAN损伤的HK-2细胞的生存率，明显降低VAN损伤细胞LDH活性和细胞内ROS水平，并提高细胞悬液中CAT活性，且作用表现出一定的浓度效应。表明TSⅡA有效地减低了VAN损伤HK-2细胞内的氧化反应。细胞凋亡结果显示TSⅡA有效降低VAN诱导HK-2细胞的凋亡率，且在实验设计的度范围内具有剂量依赖性。由此可推断TSⅡA可能通过降低HK-2细胞内氧化反应，从而减轻细胞凋亡，从而对VAN损伤的HK-2细胞起到保护作用。本课题组前期研究还证实TSⅡA磺酸钠注射液能有效的降低VAN损伤大鼠体内的氧化应激反应，改善损伤大鼠的肾功能，减轻肾脏的病理变化，对VAN损伤大鼠氧化指标和肾功能均具有改善作用[11]。结合本实验研究结果和前期研究结果，可推断氧化应激反应是VAN肾损伤的可能机制，而TSⅡA则可通过清除细胞的氧自由基以及提高自由基清除酶的活性，而减少细胞氧化损害，延缓肾脏毒性的发展进程，从而起到保护VAN损伤的作用。

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（收稿日期：2018-01-15 本文编辑：李岳泽）