乳疾康注射液工艺研究

李小进

（山西省医药与生命科学研究院，山西太原 030006）

奶牛乳腺疾病[1]主要是乳腺炎[2]，是奶牛的常见病和多发病[3]，其发病率达40%以上，它不仅影响牛奶的质量和产量，而且也直接威胁人们的身体健康[4]。

对于奶牛乳腺及子宫疾病，目前主要是通过西药抗生素进行治疗[5-6]。由于抗生素的使用相当频繁，一方面，大量饮用牛奶，提高了人体素质；另一方面，奶农为了提高牛奶产量不得不大量使用抗生素对奶牛进行治疗和预防，给人体的健康带来新的隐患[7-8]；而牛奶加工企业为了满足抗生素指标的要求，拒收含有抗生素成分的牛奶，或违规对使用过抗生素的牛奶以低于市场价40%～50%的价格进行收购，不仅给广大消费者带来健康风险，也为奶牛养殖者带来巨大的损失。

因此，开发新的无残留、无耐药、无副作用的纯中药[9-10]——乳疾康，将会取得良好的社会效益和经济效益。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料 中药饮片蒲公英、金银花、连翘均采购自山西省绛县南樊镇。

1.1.2 试剂与设备 0.45 μm微孔滤膜、硅藻土、注射用活性炭、甲醇及磷酸（分析纯）、色谱级乙腈均采购自山西国药集团化学试剂有限公司；对照品咖啡酸、绿原酸均采购自中国药品生物制品检定所。中药提取设备、旋转薄膜蒸发器、烘箱、紫外分光光度计、高效液相色谱仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 处方选择 根据发病机理查阅了大量文献发现，复方蒲公英注射液治疗动物乳腺炎具有明显的疗效[11-12]。蒲公英具有散结化淤，抗菌消炎之功效[13-14]，自古就是治疗人体乳腺炎的良药[15]；金银花具有清热解毒，抗菌消炎之功效[16]，能有效提高蒲公英治疗效果；连翘具有清热解毒，抗菌消炎之功效[16]，能有效提高蒲公英、金银花抗菌消炎之功效。根据现有中药注射剂中药成分不宜过多等原则，选取蒲公英、金银花、连翘3味药[17]作为本项目研究处方。通过与多位临床兽医研究确定，其基本处方为：蒲公英 10 g，金银花 5 g，连翘 5 g。

1.2.2 蒲公英含量测定方法 用HPLC法测定蒲公英以及乳疾康注射液中咖啡酸与绿原酸含量[18-19]。

1.2.2.1 标准品溶液的制备 精密配制每毫升含咖啡酸 40 μg、绿原酸 20 μg（混合）的甲醇溶液，作为HPLC法测定样品中咖啡酸和绿原酸含量用的标准溶液。

1.2.2.2 检测波长的确定 取含有100 μg/mL咖啡酸和50 μg/mL绿原酸的甲醇混合溶液，置紫外分光光度仪上进行扫描，根据扫描结果，选择最大吸收波长作为标准溶液的检测波长。

1.2.2.3 色谱条件与系统适应性 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸（含0.1%磷酸的水溶液）与乙腈的体积比（85∶15）为流动相，流速1.0 mL/min；检测波长322 nm，各化合物之间分离度符合要求。

1.2.3 提取方法选择 蒲公英作为本研究处方的主药，首先对其提取工艺[20-21]进行了研究。取蒲公英1 000 g，于60℃烘烤6 h，恒质量得样品930 g，粉碎过0.59 mm筛，作为原药材样品。取样品20 g共3份，分别采用水加热回流、超声提取和甲醇加热回流进行提取，各3批次，测定提取固体含量，能够有效避免目前尚不清楚有效成分的遗漏，因此，选取固体含量最高者作为本提取方法考量条件之一。

1.2.4 乳疾康注射液制备工艺

1.2.4.1 考察提取液有无异常现象 分别取蒲公英（粉碎过0.25 mm筛）10 g，金银花5 g，连翘（粉碎过0.25 mm筛）5 g，加自来水50 mL浸泡30 min，加热回流30 min，趁热过滤，滤渣加水30 mL，加热回流20 min，过滤，合并滤液，浓缩到15 mL，冷却过滤，合并3种滤液，加热回流30 min，观察有无沉淀、浑浊、气体释放等现象。

1.2.4.2 单味药分别提取考察 蒲公英：取蒲公英600 g，粉碎过0.25 mm筛，分成12份，每份50 g，分4组标注，每组3批。分别用自来水浸泡30 min，第1组，各加水200 mL，加热回流45 min，趁热过滤，滤渣加水100 mL，回流30 min，合并滤液，减压浓缩，100℃烘干至恒质量，称质量。第2组，各加水300 mL，加热回流 45 min，趁热过滤，滤渣加水150 mL，回流 30 min，合并滤液，减压浓缩，100 ℃烘干至恒质量，称质量。第3组，各加水500 mL，加热回流45 min，趁热过滤，滤渣加水200 mL，回流30 min，合并滤液，减压浓缩，100℃烘干至恒质量，称质量。第4组，各加水200mL，在45℃超声45min，过滤，滤渣加水100 mL，在45℃超声30 min，过滤，合并滤液，减压浓缩，100℃烘干至恒质量，称质量。金银花和连翘各取600 g，分别按蒲公英单味提取所述方法操作。

1.2.4.3 处方药混合提取考察 分别取粉碎并过0.25 mm筛的蒲公英800 g、金银花400 g、连翘400 g，蒲公英、金银花、连翘以2∶1∶1的比例混合均匀，分成12分，每份100 g（多余部分弃去），按照蒲公英单味提取所述方法操作。

1.2.4.4 注射剂小试样品提取及制作工艺 中间体制备：取中药材蒲公英500 g，金银花250 g，连翘250 g，粉碎混合，加水3 000 mL浸泡30 min，再加水3 000 mL，煮沸45 min，过滤；滤渣加水3 000 mL，煮沸30min，过滤；合并滤液，减压浓缩至约500mL，加硅藻土500 g，旋转减压干燥，转移至烘箱中，100℃烘干至恒质量，冷却包装保存，性状为深黄色粉末，无结块，易干燥。

小试样的制备：取本品38.8 g，加注射用水100 mL，在45℃超声提取30 min，过滤，滤渣加注射用水50 mL，在45℃超声提取30 min，过滤，合并滤液，浓缩至35 mL，在4℃条件下，放置24 h，过滤，滤液加注射用水至100 mL，加注射用活性炭0.02 g，于60℃保温30 min，过滤、精滤，分装于10 mL西林瓶中，于105℃灭菌30 min，制成每瓶含2.5 g蒲公英（按蒲公英质量计算）注射剂样品。

2 结果与分析

2.1 蒲公英含量测定

2.1.1 检测波长的确定 根据扫描结果，测试溶液在322 nm处有最大吸收，因此，选择波长322 nm作为标准溶液的检测波长。

2.1.2 色谱条件与系统适应性 对乳疾康注射液进行HPLC分离，在波长322 nm处检测，各化合物之间分离度符合要求，结果如图1所示。

2.1.3 蒲公英中咖啡酸与绿原酸含量测定结果精密量取蒲公英粉末2g,共3份，分别加纯水50mL，称质量，浸泡1.5 h[22]。加热回流1.5 h，冷却至室温。加纯水补足质量，再加无水甲醇50 mL，摇匀，用0.45 μL微孔滤膜过滤，得供试品溶液，分别测定咖啡酸与绿原酸含量，结果如表1所示。

表1 蒲公英中咖啡酸与绿原酸含量测定结果 %

2.2 提取方法及工艺考察

2.2.1 考察提取液有无异常现象 对蒲公英、金银花、连翘（分别粉碎过0.25 mm筛）单味药和混合物分别采用加水浸泡、加热回流的方法进行提取，结果显示，均无沉淀、浑浊、气体释放等现象，说明本方法可行。

2.2.2 单味药提取方法考察 蒲公英、金银花、连翘各取600 g，每味药分为12份，分4组进行提取；取3种药混合均匀后按单味药分组的方法进行提取（每份含蒲公英50 g，含金银花和连翘各25 g），提取结果分别如表2～5所示。

表2 蒲公英提取物干质量和指标性成分测定结果

表3 金银花提取物干质量和指标性成分测定结果

表4 连翘提取物干质量和指标性成分测定结果

表5 混合提取物干质量和指标性成分测定结果

从表2～5可以看出，混合提取的第3组样品提取物及指标成分（咖啡酸和绿原酸）含量最多，因此，其可作为提取的最佳工艺，即将3味药混合加水500 mL，加热回流45 min，趁热过滤，滤渣加水200 mL，回流30 min，合并滤液，减压浓缩至规定体积（进一步制作注射液所需要的体积）。

从上述试验可以看出，对注射液及原料的咖啡酸和绿原酸进行含量测定，采用高效液相色谱法，检测方法为紫外分光光度法，在322 nm波长处检测含量，处方中的药材提取，是以加水回流提取混合药材为最佳方法；利用处方提取液制备注射液，并使用硅藻土进行处理制备得到澄明合格的乳疾康注射液（质量标准制定另行研究）。

3 讨论与结论

本研究结果表明，各味中药提取液无沉淀、浑浊、气体释放现象，说明在制作工艺是可行的。通过不同提取工艺结果对比分析，各味中药单药提取后混合与混合提取有明显的差别，混合提取效果明显优于单味药提取，说明中药提取方法很重要，不同的提取方法可能会得到不同的结果和疗效。分析原因，可能是由于不同药材含有不同的酸碱性物质，在提取过程中生成盐类物质，同时，含有大量相同或相类似物质，产生同离子效应，从而提高提取率。

通过注射剂制备工艺（采用加水回流提取，利用硅藻土处理提取液的制备工艺）研究，改变了现有的水煮酒沉的方法，取得了较好的效果。

由于中药复方的复杂性，提取物质量作为优选提取方法的主要依据，高效液相色谱法含量测定仅可以作为优选提取方法的参考依据，但为制定乳疾康注射液质量标准打下良好的基础。