规模化猪场副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌控制性研究

王治方 ，焦文强 ，张青娴 ，朱文豪 ，李海利 ，方剑玉 ，张立宪 ，郎利敏 ，许 峰 ，娄治国 ，王克领 ，徐引弟

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002）

2017年6月，河南豫北某规模化猪场断奶仔猪突然发生高烧、精神沉郁、食欲减退或不食，咳嗽喘气、呼吸困难，四肢无力的传染性病例，发病率为20%，死亡率为80%，病程为10 d左右。该疫情通过临床症状和病理变化情况，初步怀疑为病毒和细菌混合感染引起的呼吸道综合征。

规模化猪场常见的细菌性疾病主要有副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪传染性胸膜肺炎、猪大肠杆菌病等[1]；常见的病毒性疾病主要有猪伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸障碍综合症、猪圆环病毒病等。在生产实际中，单一病原感染较为少见，常常是2种或2种以上病原混合感染，为疾病的诊断和防控带来很大困难[2-4]。

本研究通过对规模化猪场断奶仔猪的突发疫病开展临床诊断、实验室病原分离鉴定及动物试验，从而确定了本次发病是由3种细菌混合感染所致；同时进行了药物敏感试验，并且采取针对性用药的措施，及时控制了病情，旨在为规模化猪场应对突发性疫病采取快速有效的防控措施提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源 无菌采集2头濒死期病猪的肺脏、淋巴结、脾脏等病料组织保存，待实验室检测。

1.1.2 试剂 TSA，TSB（美国），购自碧迪医疗器械（上海）有限公司；新生牛血清，购自郑州益康生物工程有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（辅酶I，NAD），购自Roche公司；抗生素药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；微生物微量生化鉴定管，购自杭州天和微生物试剂有限公司；微生物DNA提取试剂盒、DNA Marker DL2000、胶回收试剂盒、Lording buffer等均购自宝生物（大连）工程有限公司。副猪嗜血杆菌引物、多杀性巴氏杆菌引物和化脓隐秘杆菌引物均为河南省农业科学院畜牧兽医研究所设计合成。

1.1.3 试验动物 20 g左右的小白鼠10只，购自郑州大学实验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 病原的分离、纯化 将先前无菌采集的肺脏、气管、肝脏分别接种于TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD），放置于5%CO2培养箱，37℃培养24～48 h，挑选可疑菌落纯化、染色镜检。

1.2.2 生化鉴定 挑选纯化好的单个菌落分别接种于TSB（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD）液体培养基中，放置于CO2培养箱中37℃培养24～48 h，分别取15 μL接种于不同的微生物鉴定微量生化管中，放置于CO2培养箱，37℃培养24～48 h，观察比对记录生化结果，参照微生物鉴定系统鉴定。

1.2.3 可疑菌PCR扩增检测 取上述TSB液体培养物1 mL于离心管中，10 000 r/min离心5 min，弃上清收集菌体沉淀；用微生物DNA提取试剂盒提取菌体DNA，进行可疑菌PCR扩增鉴定。

PCR反应体系（25 μL）：PCR扩增预混和溶液13 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O5 μL，模板 5 μL。PCR 反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃30 s，40个循环；72℃延伸5 min。

电泳：取10 μLPCR扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳跑胶检测，比照DNA Marker DL2000确定条带大小。

测序：分别将PCR扩增产物送生工生物工程（武汉）股份有限公司纯化、测序，每个测序结果分别进行BLAST比较。

1.2.4 药物敏感性试验 药敏试验采用琼脂扩散法（K-B法），判断标准参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）2005版[5-6]。分别挑取已纯化过的TSA平板上若干单个菌落，置于0.9%灭菌生理盐水中，制成均匀悬液，浓度为0.5麦氏单位（比色仪比色），取200 μL用灭菌棉拭子均匀涂抹于TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD）上，每种可疑菌涂抹4个平板。挑取临床上常有的抗生素药敏片，用灭菌镊子把药敏片均匀贴在涂有菌液的平板上，于37℃培养24～48 h，取出观察记录药敏片抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 临床诊断及病理变化

送检2头濒死期病猪精神沉郁，高烧（体温41℃），被毛粗乱，咳嗽气喘，腹式呼吸，四肢无力，不愿站立。剖检病猪可见全身淋巴结肿大、多汁；气管充满大量泡沫黏液；肺脏出血、发生不同程度的实变，有少量的纤维性蛋白渗出，病程稍长的那头病猪肺脏可见大小不一数量不等的化脓灶（图1，2）；心肌偏软，脾脏稍肿大，其他脏器未见明显病变。

2.2 细菌分离培养、镜检、纯化

从2头病死猪气管、肺脏接种的TSA平板上均长出多种菌落，共挑选出3种可疑菌落。在培养24 h后，接种气管、肺脏的TSA平板上均长出一种圆形、表面光滑、湿润、不透明、带有荧光的露滴样优势菌落；挑取单个菌落染色镜检为革兰氏阴性，单个存在，偶见成双存在的球杆菌；挑取单个菌落接种TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）37℃培养24 h生长良好，暂定为A（图3）。培养24～36 h，接种气管、肺脏的TSA平板上长出一种光滑、湿润、略带灰白色的针尖大小菌落；挑取单个菌落染色镜检为革兰氏阳性，多形态的细小杆菌，大多单个存在；挑取单个菌落接种TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）37℃培养24 h，菌落形态太小不明显，36 h后菌落形态趋于正常，暂定为B（图4）。培养36～48 h后，在接种肺脏的TSA平板上又长出一种光滑、湿润、透明，带有淡蓝色荧光的小菌落，挑取单个菌落染色镜检为革兰氏阴性，大多呈长丝状，少量细小杆菌存在；挑取单个菌落分别接种TSA平板（含5%的新生牛血清，含1/100 000 NAD）和TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD），37℃培养48 h后，接种TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）的未见细菌生长；接种TSA平板（含5%的新生牛血清，含1/100 000 NAD）有均一的光滑、湿润、透明的小菌落生长，暂定为C（图5）。

2.3 生化试验结果

对3种细菌分别进行生化特性鉴定，每个生化反应依据试剂盒说明书的判定标准判断阴性、阳性，综合多个生化反应结果（表1），可疑菌A初步判定为多杀性巴氏杆菌；可疑菌B初步判定为化脓隐秘杆菌；可疑菌C初步判定为副猪嗜血杆菌。

表1 生化试验结果

2.4 PCR扩增、测序鉴定结果

对3株分离菌株的16S rRNA基因PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳显示，分别在457，1 358，821 bp处扩增出3条特异性条带，分别与多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、副猪嗜血杆菌的目的条带大小相符。PCR扩增产物经BLAST序列比对，结果显示，3种分离细菌的16S rRNA序列分别与多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、副猪嗜血杆菌同源性达97%，表明3种细菌分别为多杀性巴氏杆菌、化脓隐秘杆菌、副猪嗜血杆菌。3种细菌16SrRNA的PCR扩增电泳结果如图6所示。

2.5 病毒性疾病的检测

通过对可疑病料进行猪繁殖与呼吸道综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒扩增检测，4种病毒病均为阴性，排除了病毒感染的可能性。

2.6 动物试验

3种分离菌株的24 h培养物分别通过腹腔接种小白鼠 2只，1 mL/只（2×107cfu/mL）；灭菌生理盐水腹腔接种小白鼠4只，1 mL/只。分笼单独饲喂。接种后18～20 h，多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌接种的小白鼠精神萎靡，活动减缓，有发病迹象。接种后24 h，化脓隐秘杆菌接种的小白鼠萎靡、迟钝、发病。28 h多杀性巴氏杆菌接种的小白鼠死亡；36 h副猪嗜血杆菌接种的小白鼠死亡；40 h化脓隐秘杆菌接种的小白鼠死亡1只，另一只严重沉郁。小白鼠死亡后，立即解剖心血、肝脏触片，革兰氏染色镜检，均发现相对应接种菌株。同时无菌采集死亡小白鼠的心血、肺脏、肝脏接种TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD），均获得相对应的单一细菌。

根据临床症状、病理变化、实验室检测结果等情况，综合判断该场本次疫情是有副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌混合感染所致。

2.7 药敏试验结果

挑选6类19种抗生素对3种细菌分别作了药物敏感性试验（表2）。通过药敏试验可以看出，19种常用抗生素中只有头孢噻肟、头孢拉定、亚胺培南、左氟沙星、恩诺沙星、壮观霉素对这3种细菌同时高度敏感。

表2 3种细菌的药物敏感性试验结果

3 治疗、控制

根据药敏试验结果，猪场全群饲料添加左氟沙星300 g/t，阿莫西林300 g/t，连用5 d；对发病不食或食欲下降猪只，肌肉注射药物（壮观霉素+氨基比林+维生素C），每天2次，连用3～5 d。饮水中添加电解多维，自由饮用，同时加强猪舍环境消毒，1次/d，降低猪群密度，加强猪舍通风换气，减少猪群应激。

通过采取以上控制措施，除第2天死亡3头外，发病猪于第3天好转，全群未出现新的病例，5 d后猪群基本恢复正常。

4 结论与讨论

本次疫情从疑似病例中同时分离出副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌3种病原菌，而病毒性疾病为阴性，临床上较为少见。

本次分离到的3种细菌均属于条件致病菌，副猪嗜血杆菌为革兰氏阴性多形态、细小杆菌，常寄生于猪的上呼吸道，临床上常引起猪的以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为特征的疾病，呈世界性分布[7-8]，临床上常引起断奶保育仔猪较高的发病率和死亡率，是当前养猪业主要致病菌之一。多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性球杆菌，常存在于健康动物的呼吸道和消化道黏膜，是人畜共患的致病菌[9]。各种年龄的猪只都可感染，是引起猪呼吸道综合征的常见病菌，世界各地均有流行。化脓隐秘杆菌为革兰氏阳性多形性杆菌，常寄生于猪、牛、羊的黏膜上，可感染人。临床上常引起局部化脓性感染，临床表现以肺炎、关节炎、心内膜炎为主[10]，为条件致病菌，在养猪生产中也是较罕见的致病菌之一。

在生产实际中，细菌性疾病极易和病毒如PRRSV，PRV和PCV2混合感染，或继发于病毒感染之后，造成预防和治疗困难[11]。该规模化猪场病毒性疾病的免疫预防做的比较到位，因此，没有发生病毒性疾病。综合分析本次发病主要与猪场猪群密度过大、圈舍环境卫生差、空气不良应激大有很大关系。

该猪场长期使用磺胺类药物、大环内酯类药物和四环素类药物，预防弓形体、衣原体和呼吸道疾病，该猪场细菌已对大环内酯类和磺胺类药物产生了一定的耐药现象，对喹诺酮类和β-内酰胺类抗生素敏感性高。生产实际中，猪场兽医工作人员一定要摒弃临床经验性用药的不良习惯，借助药敏试验指导生产科学合理用药，减少或延缓细菌耐药性的产生。