免疫亲和柱净化-HPLC-FLD法测定天麻药材中黄曲霉毒素的含量

张玉莲　宋　嬿　郑希望

（上海上药华宇药业有限公司，上海200001）

0　引言

黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，主要是由黄曲霉（aspergillus flavus）、寄生曲霉（a.parasiticus）产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物。

目前已发现的黄曲霉毒素有二十余种，主要的有B1、B2、G1、G2四种，其中毒性最强的为B1。

天麻（Gastrodiae rhizome）来源于兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，其具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络的功效，是名贵中药材。研究并建立天麻药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量的测定方法，可以为天麻药材质量的评价与控制提供依据。

本研究采用免疫亲和柱净化-高效液相色谱（HPLC）-荧光光度检测（FLD）法，测定天麻药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。

1　材料与仪器

1.1　材料

1.1.1天麻药材

天麻药材均从各产地直接购买，并经上海市中药行业专家张增良老师鉴定为天麻Gastrodiae rhizoma。

1.1.2主要试剂

乙腈、甲醇（色谱级），购自德国默克公司；氯化钠（优级纯）、碘（分析纯）、吐温-20，购自国药化学试剂公司；免疫亲和柱，购自美国Beacon公司；黄曲霉毒素混合对照品（98%），购自上海安谱公司；PBS缓冲液，购自德国GE公司；亲水性PTFE微孔滤膜（25 mm×0.45μm），购自上海驷虎科技公司。

1.2　仪器

1.2.1仪器配置

Agilent 1200 Series高效液相色谱仪（配套FLD检测器），安捷伦公司；Pickering Vector柱后衍生化仪，美国Pickering公司；METTLER TOLEDO XS205DU分析天平，梅特勒-托利多公司；Anke TDL-5000B离心机，上海安亭公司；Milli-Q Reference纯水机，密理博公司。

1.2.2色谱条件

色谱柱：安捷伦Poroshell EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相：甲醇:乙腈:水=18:18:62；流速：1 mL/min。

FLD检测器激发波长360 nm，发射波长450 nm，PMTGAIN值15；相邻两个峰的分离度应大于1.5。

柱温35℃的柱后衍生化法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5 g，加入甲醇100 mL使其溶解，用水稀释至1 000 mL），衍生化泵流速0.3 mL/min，衍生化温度70℃。

进样量：20μL。

2　方法

2.1　标准溶液的制备

精密量取黄曲霉毒素混合对照品（黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的标示浓度分别为1.0 μg/mL、0.3 μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL，纯度均为98%）1 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液；精密量取储备液1 mL，置于5 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2　供试品溶液的制备

精密称定天麻药材粉末2 g，置于50 mL离心管中，加入50%乙腈水溶液30 mL，用手持匀浆机高速搅拌2 min，加入氯化钠2.5 g，振摇或涡旋至溶液分层，离心5 min（离心速度4 000 r/min）；精密量取上清液6 mL，置于50 mL离心管中，加含0.1%吐温-20的PBS缓冲液40 mL，摇匀，全部转移至免疫亲和柱（以少量缓冲液多次润洗离心管，并转移至免疫亲和柱），流速3 mL/min，用20 mL水洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子将水挤出，加入甲醇1.4 mL洗脱，收集洗脱液，置于2 mL量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

2.3　测定方法

2.3.1标准曲线的绘制

取稀释后的混合标准品溶液进样，进样体积分别为1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL，测定峰面积，计算标准曲线。

2.3.2样品测定

取20μL供试品溶液注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，计算，即得。

2.4　方法学考察

2.4.1线性关系考察

按照2.3的测定方法，对不同浓度的混合标准品溶液进行测定，以测量值为纵坐标，浓度为横坐标，建立回归曲线，计算线性回归系数。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相关系数及回归方程如表1所示。

2.4.2加标回收率考察

精密称定天麻药材粉末2 g，置于50 mL离心管中，精密加入0.25 mL、0.5 mL、0.75 mL混合对照品储备溶液，混匀，3个不同浓度的储备溶液每个平行制备3份，再精密加入50%乙腈30 mL，按照2.2项的方法，自“用手持匀浆机高速搅拌2 min”起，同法制备。

按照2.3项的方法进样测定，计算回收率，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2加标回收率结果如表2所示。

表1　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的相关系数及回归方程

2.4.3精密度考察

按照2.4.2加标回收率中的处理方法，添加0.5 mL混合对照品储备液，平行制备6份，进样测定，计算含量RSD。黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度试验结果如表3所示。

2.4.4检出限和定量限考察

以回收率试验中的低浓度样品为例计算信噪比，根据3倍信噪比值和10倍信噪比值对应的黄曲霉毒素含量，计算检出限和定量限。

黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检出限和定量限试验结果如表4所示。

3　结果与分析

3.1　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2线性回归方程及相关系数

由表1可知：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2在各自浓度范围内有良好的线性关系，相关系数r均≥0.998 5。

3.2　加标回收试验结果

由表2可知：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的回收率在87%～108%之间，方法准确可靠，可用于天麻药材中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量测定。

3.3　精密度试验结果

由表3可知：黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的精密度试验RSD分别为1.3%、0.9%、3.5%、2.9%，精密度良好。

3.4　检出限和定量限试验结果

由表4可知：检出限和定量限试验结果符合规定，该检测方法可用于天麻药材中黄曲霉毒素的定量测试。

4　不同产地天麻药材中黄曲霉毒素的含量测定结果

按上述制定的检测方法，对6个产地共13个批次的天麻药材中的黄曲霉毒素含量进行了测定，测定结果如表5所示。

由表5可知：全部批次均未检测出黄曲霉毒素，结果符合以下规定：（1）《中国药典》（2015年版），黄曲霉毒素B1≤5 μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量≤10μg/kg；（2）《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》，黄曲霉毒素B1≤5 μg/kg；（3）《美国药典》，植物药中的黄曲霉毒素B1≤5μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量≤20 μg/kg。

表2　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2加标回收率

表3　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2精密度试验结果

表4　黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2检出限和定量限试验结果

5　结语

（1）本研究在前处理阶段采用50%乙腈水溶液提取的方法，经过加盐分层，可以去除大部分的水溶性杂质，降低水溶性杂质对免疫亲和柱的干扰。同时，使用淋洗液可以促进提取液中杂质成分的溶解，降低其在免疫亲和柱上的吸附，从而提高免疫亲和柱的纯化效果，减少杂质干扰，有助于实现天麻中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的定量检测。

（2）本研究无需使用微孔滤膜或玻璃纤维滤膜过滤，降低了实验成本，减少了前处理时间。

（3）本研究共收集了6个主产区的13批天麻药材，均未检测出黄曲霉毒素，表明经规范生产、加工、运输及贮存的天麻不易受黄曲霉菌的侵染。