液相芯片技术在动物病原微生物检测中的应用

（浙江省动物疫病预防控制中心，浙江杭州 311199）

液相芯片技术（Multi-analyte profiling，solve for unknown x，xMAP technology），是20世纪90年代中期美国 Luminex公司开发出的被喻为后基因组时代的芯片技术。它以微球体代替细胞作为反应载体，可进行蛋白、核酸等生物大分子的检测，不仅从细胞水平深入到分子水平，其检测范围也得到前所未有的扩展。现就液相芯片的技术原理、特点及其在动物病原微生物检测方面的应用做一综述。

1 基本原理

1995年，美国Luminex公司将流式细胞仪、数字信号处理器和一种激光检测装置相结合，开发了一种具有多指标同步分析（xMAP）功能的芯片技术，也称为液态芯片（Liquid chip）或悬浮芯片（Suspension array）。基本原理是：

xMAP技术以流式细胞仪为检测平台，用许多大小均一稳定的微球为载体，微球内部含有三种荧光免疫荧光，通过荧光不同的比例可以区分500种不同的微球，每种微球可以用来检测一种不同的蛋白或基因。该技术利用荧光编码的微球共价交联单克隆抗体，与被测定的目标分子结合后，加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量“检测荧光”强度来确定被测分子的浓度。所得到的数据经计算机处理后，用配套软件分析即可直接用来判断结果。

2 液相芯片的特点

2.1 高通量、速度快

可在同一反应体系中放入不同编码的微球，每种微球对应一种检测物质。利用Luminex公司开发的3色荧光编码技术，10µl微量标本可检测多达500个指标，提高了标本的利用率，实现了样品的高通量检测。整个杂交反应在液相环境中进行，使得杂交反应动力学显著加快，效率显著提升，大大地缩短了杂交时间，最快可达10 000测试/h。

2.2 特异性好，灵敏度高

微球的表面积大，先通过特异性的PCR将靶分子数量扩大，再通过特异性的探针与目标分子杂交，每个微球能结合约（1～2）×106个探针分子，反应时荧光信号强；两束不同激光分别检测微球上的分类荧光信号和报告基团上的荧光信号，两种信号同时存在时才可以检测分析。微球表面还可以进行化学处理，进一步地提高反应的特异性。

2.3 应用范围广、重复性好

在微球表面上包被不同的抗原、抗体、细胞因子、核酸等生物分子，便可检测相应的目标物；可以应用商品化检测试剂盒或者根据检测物质的不同特点，利用分子杂交原理自行设计方案。液相芯片技术相比于以往固相芯片技术，降低了固相芯片在大分子检测时受空间效应、表面张力等很多反应动力学的干扰，并且增加了检测结果的稳定性，提高了检测样品的重复性。检测的重复性可以达至90%以上，线性范围宽，动态范围可达4～6 个数量级。

2.4 操作简便、经济实惠

应用液相芯片一次检测就能完成多份样品多个指标同时检测，节约了试剂，耗材及劳动力，降低了样品检测的成本，提高了分析的效率，液态芯片在大大提高检测效率的基础上，检测试剂比用其他方法检测相同指标时价格更实惠。检测仪器和消耗品相对固相芯片技术也便宜。

3 液相芯片在动物病原微生物检测中应用

3.1 液相核酸芯片

朱海红等（2007）基于悬浮芯片技术建立的狂犬病毒等56种病原微生物的高通量检测微生物诊断技术平台，高通量、快速、可靠且经济，为突发传染病的病原体诊断提供技术储备。詹爱军等（2010）建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒等4 种虫媒病的快速高通量液相芯片技术，这四种虫媒病是世界动物卫生组织（OIE）规定的法定报告动物疫病和我国农业部规定的一、二类动物传染病，为防止此类疾病进入我国以及监控其在我国的流行提供了重要的技术储备。张晓娜等（2012）成功建立了检测H5、H7、H9禽流感，新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等6种病毒的液相芯片检测方法，敏感性、特异性和稳定性均较好。王晶钰等（2012）成功建立了PPV、PCV2 二重xMAP检测方法，该方法与标准 PCR检测符合率为100%，该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验。王政等（2017）建立虾桃拉病毒、黄头病毒和白斑病毒检测方法，检测灵敏度高分别为401.5、251.5和75.2 copies。除了检测病毒，近年来也有学者采用液相基因芯片进行细菌、真菌等临床鉴定。

3.2 液相蛋白芯片

卢爱桃等（2008）建立了一种可以同时检测猴T淋巴细胞白血病毒I型、猴单纯疱疹病毒两种病毒抗体的液相芯片技术，对比ELISA与流式荧光微球检测结果，证明用荧光微球对猴血清进行检测，不仅比ELISA法快速省时，而且灵敏度比间接ELISA法高出～100倍。刘志玲等（2012）用xMAP蛋白芯片技术建立牛地方流行性白血病的检测方法，实验结果显示对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7 ng/µl；批内、批间的变异系数均小于10%，试验重复性良好；所制备的偶联微球芯片保存3个月，其检测结果无显著差异，稳定性好。蔡月琴等（2013）应用制备的兔IgG、IgM和IgA液相芯片建立的xMAP方法，对实验兔血清进行检测，检测结果与ELISA结果一致，提示该方法可应用于实验兔血清的IgG、IgM和IgA半定量检测。

4 液相芯片的应用前景

液相芯片技术可用于多种生物分子（核酸和蛋白质）检测，但是这项技术仍存在着一些难点和缺陷，如不同探针间温度的差异、检测血清中特异性抗体时检测的背景值高对实验造成干扰等。我们可以相信，随着研究的不断进展和深入，这些缺陷会很好的得到解决，今后这一技术会成为临床诊断、基础研究、新药开发、司法鉴定、食品卫生监督、生物武器防范等领域一项重要的分析检测技术，将大大推动生命科学的研究与发展。