pH值对白斑狗鱼蛋白酶活性的影响

2018-07-12王拥军张家松毛瑞鑫

水产养殖 2018年7期

王拥军，张家松，毛瑞鑫

（吉林省水产科学研究院，吉林　长春　130033）

白斑狗鱼（Esox lucius）属鲑形目（Salmoniformes），狗鱼亚目（Esocoidei），狗鱼科（Esocidae），狗鱼属（Esox）。主要分布于欧洲、亚洲和北美洲，在我国仅分布于新疆阿勒泰地区的额尔齐斯河流域以及附属水体[1]，以银鲫、贝加尔雅罗鱼、尖鳍鮈等中小型鱼类为食，是典型的凶猛性肉食性土著鱼类[2]。

我国目前对于白斑狗鱼的研究主要集中在人工养殖方面[3-5]。但关于白斑狗鱼越冬期pH值对蛋白酶活性影响的研究与报道少之又少。消化酶活性与环境因素有密切关系，其中pH值是主要影响因素，通过对白斑狗鱼蛋白酶进行的系列研究,期望在白斑狗鱼越冬过程中对饵料选择、配合饵料的研制等方面有所帮助,提高白斑狗鱼越冬成活率和增重率。该文报道pH影响白斑狗鱼蛋白酶活性的初步研究结果,供有关方面参考。

1　材料与方法

1.1　白斑狗鱼来源

引自新疆、养殖地在长春养殖越冬后的白斑狗鱼，取4条鱼体健康体型匀称，平均体质量为304.9 g，体长平均为38.1 cm。

1.2　试验试剂

标准蛋白酶溶液、0.9%NaCl溶液、考马斯亮蓝染液、新鲜牛奶、95%乙醇、酚酞试剂、0.01 mol/L的NaOH溶液、1%淀粉溶液、0.025 mol/L磷酸缓冲液、pH为6.9的磷酸缓冲液、3,5-二硝基水杨酸显色液、6 mol/L NaOH、蒸馏水、10 g/L酪蛋白、0.025 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.5）、10%的三氯醋酸、0.55 mol/LNa2CO3、Folin-酚试剂、0.2 mol/L 磷酸二氢钠-柠檬酸钠缓冲液。

1.3　试验器材

分光光度计、试管、试管架、三角烧瓶、玻璃棒、水浴锅、研钵、磁力搅拌器、吸量管、移液管、比色杯、剪刀、直尺、电子天平、药勺、烧杯、漏斗。

1.4　酶粗液的制备

将白斑狗鱼先在冰箱中冷冻保存，取鱼4尾随机分成两组，每次取一组进行试验，重复两次，参照刘玉梅等[6]的方法制备粗提取液，测定蛋白酶的活性。在冰盘上解冻并解剖白斑狗鱼，剪取从口至肛门的消化道，剔除外壁脂肪后，称重。将所取样品加10倍体积预冷蒸溜水，在0～4℃下研磨成匀浆，取部分匀浆直接用于测定脂肪酶的活性，反应温度37℃。其余部分放在4℃冰箱中静置抽提20～28 h，以便充分提取蛋白酶，然后高速冷冻离心（0～4℃，10 000 r/min）30 min，取上清液，即为酶粗提液。

1.5　酶液中粗蛋白含量的测定

粗蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法进行测定[7]。

1.6　蛋白酶活性的测定

蛋白酶活性的测定参照Folin-酚法[8]。取10 g/L酪蛋白1 mL和0.025 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.5）5 mL于试管中，37℃下保温10 min，迅速加入1 mL酶液，再继续保温15 min，加入3 mL 10%的三氯醋酸终止反应，过滤或离心，取上清液1 mL，加入5 mL 0.55 mol/L Na2CO3和 1 mL Folin试剂，37℃水浴中显色15 min，于波长680 nm条件下，在1 cm比色管中进行比色测定。对照管先加入终止液后加酶液。酶活性定义为每分钟产生1 g酪氨酸为1个蛋白酶活性单位。

1.7　磷酸缓冲溶液及pH值梯度的设定

以0．2 mol/L磷酸二氢钠－柠檬酸钠缓冲液调节pH值，在37℃恒温水浴锅条件下。pH值梯度因部位不同而有区别，胃的pH梯度设定为2．0～6．5范围内,以pH值0．5为一个梯度，肝胰脏pH值梯度设定为 3．0～7．5 范围内,以 pH 值 0．5 为一个梯度，肠 pH 梯度设定为 5．0～9．5 范围内，以 pH 值 0．5 为一个梯度测出各部位蛋白酶在37℃下最适宜的pH值。

1．8　数据处理

该研究用Excel对结果进行处理，并用SPSS统计软件进行分析，P＞0．05即认为差异具统计学意义。

2　结果与分析

2．1　pH值对蛋白酶活性的影响

在 37℃下，胃蛋白酶在 pH 值 2．0～3．5 之间活性迅速上升，在pH 3．5时活性达到最高为26．056 U,此后，随pH值增加，活性快速降低，胃蛋白酶的最适宜 pH 值为 3．5；肝胰脏蛋白酶在 pH 值 2．0～3．0之间活性迅速上升，在pH值3．0时活性达到最高为13．923 U，此后，随pH值增加活性开始降低，在3．0～4．5 之间迅速降低，4．5 后缓慢降低，肝胰脏的最适 pH 为 3．0，前肠蛋白酶在 pH 值 8．0～9．0 之间活性成上升趋势，在 8．0～8．5 之间上升缓慢，在 8．5 之后上升幅度迅速加大，在pH 9．0时活性达到最高为为6．89 U，此后，随pH值增加活性迅速降低，前肠最适 pH 值为 9．0，中肠蛋白酶在 pH 值 7．5～8．5 之间活性迅速上升，在pH值8．5时活性达到最高为7．856 U；此后，随pH值增加活性快速降低中肠最适pH值为8．5，详见图1和图2，胃和肝胰脏蛋白酶的最适宜pH值在酸性范围，前肠和中肠蛋白酶的最适宜pH值在碱性范围内。

2．2　蛋白酶的活性比较

白斑狗鱼不同器官蛋白酶活性在最适宜pH值条件下，蛋白酶的活性：胃＞肝胰脏＞中肠＞前肠（P＜0．05），胃适蛋白质的主要消化场所，依次是肝胰脏和肠，在肠中，中肠消化酶活性强于前肠，是蛋白质的主要消化场所，详见表1和图3。

图1　pH值对肝胰脏和胃中蛋白酶活性的影响

图2　pH值对前和中肠中蛋白酶活性的影响

表1　白斑狗鱼不同消化器官中蛋白酶的活性

图3　白斑狗鱼不同消化器官中蛋白酶的活性

3　讨论

3.1　越冬与蛋白酶

该试验所采用的是越冬期间的白斑狗鱼，在最适宜pH值条件下，肝胰脏蛋白酶：13.923 U/(min·g)；胃蛋白酶活性为：26.056 U/(min·g)；前肠蛋白酶、6.89 U/(min·g)；中肠蛋白酶：7.856 U/(min·g)；从魏永星等人[9]的研究结果可知，白斑狗鱼越冬期间，其蛋白酶活性依然很强，因此可以得出结论，白斑狗鱼在越冬期仍正常进食。

3.2　越冬期饲料及投喂

上述试验结果表明，越冬期，在适宜的pH值条件下，白斑狗鱼其消化系统蛋白酶活性依然很强，就此可以根据越冬环境温度变化及狗鱼采食活跃程度，采用目前常规饲养模式及饲料，制定相应的投喂方式开展越冬期投饲，以此提高其增重率，进而提高越冬成活率。同时探索人工配合饲料养殖技术及应用，探索最佳配合饲料营养配比，为人工冬季养殖积累经验。