不同浓度复合维生素对海参幼苗生长性能、肠道酶活性及其免疫功能的影响

2018-07-12孙尚智刘文斌王文喜

水产养殖 2018年7期

孙尚智，刘文斌，王文喜

（1．江苏敖众生物技术有限公司，江苏　南京　223001；2．南京农业大学，江苏　南京　210095）

全世界海参约有120种[1]均属海洋种类。在我国海域分布的有10多种，其中以黄、渤海的刺参（Apostichopus japonicas Selenka）品质最佳。刺参是蛋白质含量高、糖类丰富而不含胆固醇的珍贵海产品，具有很高的食用和药用价值，其经济价值可称之为“参”中之冠[2]。现代医学证明，海参含有的酸性黏多糖对人体的成骨、生长、创伤愈合以及预防组织老化、动脉硬化等均有特殊功能[3]；五肽及三萜糖苷等成分具有抗肿瘤、抗炎活性和溶血作用[4－5]。20世纪90年代来我国沿海地区海参的人工养殖业蓬勃发展，但是由于养殖过程中的不规范运作等，使海参养殖中存在的病害问题也逐渐凸现起来，如皮肤溃疡、腐皮、水肿，给养殖户造成了惨重的经济损失[6－7]。对于海参的病害，人们至今还没有找到一个合适的解决方法，这种困境严重制约了该产业的持续健康发展[8]。维生素作为一种应用免疫增强剂，是水产动物维持正常生长和生命活动所必需的营养物质。目前，在水产养殖业界也普遍认为在饲料中添加适量的维生素是很有必要的[9]，因为大多数的维生素在水产动物体内是不能合成的，需要从饲料中额外摄取[10]。

复合维生素作为一种纳米级水产用液体维生素，主要含有维生素、肌醇、牛磺酸、氨基酸以及免疫促生长因子、抗应激活性因子等。它不仅能够满足水产动物不同生长阶段营养需求，预防维生素缺乏，还能够增强免疫力，促进食欲。

该试验就是将这种液体维生素添加到海参幼苗饲料中，通过生长性能、肠道酶活性等指标来最终确定海参幼苗对这种复合维生素的最适需求量。

1　材料与方法

1．1试验材料

1．1．1海参刺参为 2 月龄幼苗，体长 0．5～1．0 cm，总初重2．5 kg，规格为10 000头/kg左右，由山东省某有限公司提供。

1．1．2试验饲料与复合维生素试验用饲料选用鱼粉、鼠尾藻粉、海带粉、海泥、浒苔为主要原料。

1．2试验设计和养殖条件

试验在山东好当家育苗基地进行。自2014年7月10日开始，在好当家的一个生产车间，选择28个标准育苗池，每个池子为 9 m×2 m×1．2 m，设6个试验组和1个对照组，试验组分别用浓度为0．03%、0．05%、0．07%、0．09%、0．11%、0．13%的复合维生素拌料。对照组为第一组，其余分别为二、三、四、五、六、七组。每组四个重复，每个育苗池放2．5 kg，规格为10 000头/kg左右的海参苗，采用定时定量的投喂方式，每天15:30－16:00之间喂料。5～7 d倒一次池子，同时清理池底排泄物，为期2个月。

表1　复合维生素的主要组成成分保证值（每1000mL该品中含有）

1．2．1生长测定和样品采集从试验开始后的第30 d，从各水槽随机抽取20个刺参样品，置于－20℃冰箱内作为以后分析刺参生化组成的样品，在试验结束后再随机抽取20个刺参样品，测量体质量后并置于－20℃冰箱内作为生化组成分析的样品。体质量的测量方法是把刺参从培养皿中轻轻取出后，在干滤纸上放置30 s后快速用1/104电子天平称量。为了减少操作误差，试验过程中体质量的测量均由同一固定试验人员完成。刺参的饲料系数（FCR）计算公式为：

饲料系数（FCR）=投入饲料量（g）/体质量增加量（g）。

1．2．2样品生化组成的分析

1．2．2．1消化酶活性测定总蛋白酶采用福林－酚法[11]（单位定义：在27℃条件下，每分钟水解酪素产生相当于1 μg酪氨酸所需的酶量，规定为一个酶活力单位）。淀粉酶（单位定义：每毫克蛋白在27℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位）采用南京某公司试剂盒测定。

1．2．2．2吸收酶活性测定Na+,K+－ATP 酶活性（单位定义：每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量）采用南京某公司试剂盒测定。

1．2．2．3抗氧化指标测定CAT、AOC、MDA、SOD均采用南京某公司试剂盒测定。

1．2．2．4免疫指标测定

溶菌酶活性采用南京某公司试剂盒测定。

1．3数据处理对海参幼苗的生长性能，肠道酶活性及其免疫力用平均数±标准差表示（n=4），经SPSS 19．0统计软件分析。所有数据进行方差分析，并进行Duncan多重比较。P＜0．05表示差异具统计学意义，P＜0．01表示差异极具统计学意义。

2　结果

2．1添加不同浓度复合维生素对海参幼苗生长性能的影响

图1　添加不同浓度复合维生素与海参幼苗增重率的关系

由图1可以看出，在一定范围内，随着复合维生素添加量的增加，每组的增重率显著增加（P＜0．05），在达到最高点后再下降，最高点出现在第五组，即添加量为0．09%时，海参幼苗生长情况最好，复合维生素添加量超过0．09%时，增重开始下降，且除最高水平组外，试验组增重率均大于对照组，由此可见，复合维生素添加量在一定范围内可提高海参幼苗的生长速度。复合维生素添加量在0．09%时对海参的生长最有利，但是在试验中也发现第五组虽然长势最好，但是海参苗大小不均，差距很大，小苗（2 000头/kg以下）基本没长，在更高水平组也是如此，大苗（2 000头以上/kg）生长情况良好，小苗长势差。第三组和第四组，参苗较均匀，小苗均能长起来，所以使用复合维生素拌料时应大小苗区分开，大苗添加量建议在 0．07%～0．09%，小苗应控制在 0．07%以下，最好在 0．05%左右。

由图2可以看出，随着复合维生素添加量的增加，饵料系数降低，最低点出现在第五组，当添加量超过0．09%时，饵料系数又随之升高，且除第七组外其余各试验组均低于对照组，通过对比可知，复合维生素的添加可以降低饵料系数。

表2　初重、末重、增重率和投喂量

图2　添加不同浓度复合维生素与饵料系数的关系

2．2添加不同浓度复合维生素对海参幼苗肠道酶活的影响

2．2．1添加不同浓度复合维生素对海参幼苗肠道消化酶的影响

由图3可以看出，在试验开始30 d时的海参幼苗随着复合维生素添加量的增加，淀粉酶的活性有一定程度的改变，但是并不显著，且第一组淀粉酶活性高于其他组（P＞0．05）。在试验60 d的海参幼苗随复合维生素添加量的增加发生显著性变化，但是第一组的酶活性显著高于除第三组外的其他试验组（P＜0．05）。随着添加量浓度的增加，淀粉酶的活性在第五组时处于最低值。

图3　添加不同浓度复合维生素对海参幼苗淀粉酶活性的影响

在图4中，随着复合维生素添加量的增加蛋白酶活性发生了改变。在试验开始30 d时，第四组海参幼苗体内蛋白酶的活性最高但差异不具统计学意义（P＞0．05）。试验开始 60 d时，第六组海参幼苗体内蛋白酶的活性最高且变化显著（P＜0．05）。这种结果在一定程度上说明了蛋白酶受到复合维生素含量的影响。

2．2．2添加不同浓度强参液对海参幼苗肠道吸收酶的影响

由图5可以看出，经过30 d和60 d饲养试验，Na+,K+－ATPase酶活性都有相应的变化。在30 d时，对照组的酶活性显著高于其他组且第三组最低。在60 d对照组刺参组织中Na+,K+－ATPase吸收酶的活性较30 d初始酶活性有下降，但在60 d时第六组吸收酶活性显著高于除第四组外的其他各组（P＜0．05），且随后有下降。这种趋势表明强参液对Na+,K+－ATPase酶活性有一定影响。

图4　添加不同浓度复合维生素对海参幼苗蛋白酶活性（U/mg protein）的影响

图5　添加不同浓度复合维生素对海参幼苗Na+,K+－ATPase酶活性（U/g protein）的影响

2．3添加不同浓度复合维生素对海参幼苗抗氧化指标的影响

添加不同浓度复合维生素对海参幼苗抗氧化酶指标的影响见表3、表4。结果表明，经过30 d、60 d，的分组饲喂后，刺参幼苗的抗氧化酶因复合维生素添加量的不同而不同，且都有显著性的变化。在养殖30 d后CAT的活性在第2组显著高于其他组（P＜0．05），而第五组的酶活性达到最低值。但是经过60 d的饲养后CAT酶活的最高值出现在了第六组，且显著高于除第四组外的其他各组（P＜0．05），最低组出现在了对照组。对于AOC酶的活性，在养殖30 d后第一组的酶活性显著高于其他组（P＜0．05），而在60 d时第五组的酶活性又显著高于其他组（P＜0．05）。在30 d时MDA含量在第六组最高且将近是最低组的两倍，而在60 d时MDA含量在第六组达到最大值但差异不具统计学意义（P＞0．05）。对于SOD来讲，它的最大值都发生在第四组，而酶活性最低的却不是同一组。

表3　添加不同浓度复合维生素对30天海参幼苗抗氧化酶指标的影响

表4　添加不同浓度复合维生素对60天海参幼苗抗氧化酶指标的影响

2．4添加不同浓度复合维生素对海参幼苗免疫力的影响

不同浓度复合维生素对海参幼苗溶菌酶活性的影响如图6。在30 d和60 d的饲喂试验中，第四组溶菌酶活性均是最高但差异均不具统计学意义（P＞0．05）。

3　讨论

3．1　复合维生素对刺参幼苗生长性能的影响

图6　添加不同浓度复合维生素对海参幼苗溶菌酶活性（μg/mL）的影响

关于刺参的生物学特性和生理学特点，已有一些学者对其进行了研究和报道[12－13]，刺参主要生活在有机物丰富的潮间带和海洋底部，以沉积物、底栖生物以及动植物性有机碎屑为食物来源。在海参肠道内可观察到有各种无机微粒，微型海洋底栖生物，海洋动植物碎屑，贝壳碎片及其微生物。刺参不分昼夜都在积极进食，每小时大约可吞食6 g沉积物和泥沙。刺参对海洋底泥中的有机物的消化率大约为15%，对植物性饵料的消化率为67．5%～76．4%，对动物的碎屑、硅藻、细菌以及真菌的消化率最高，可达到87%[14－15]。在自然环境下，这些食物可以充分地满足海参自身生长的需求，但是对于人工养殖的刺参来讲，由于它们自身没有合成一些维生素的能力或者是体内合成的维生素量不能充分满足其生长、抗逆和抗病的需求，从而造成其成活率降低，并出现生长减缓等症状[16]，这就需要在人工喂养的海参饲料中添加一定量的维生素来满足其生长需求。目前，有关单一维生素在水生动物上的应用已有较多的报道[17－19]。例如：Okorie 等[20]用精制的海参饲料研究了0～1 045 mg/kg的维生素C对刺参［体质量：（1．49±0．07）g］生长性能的影响，这次的研究结果显示，在饲料中加入维生素C可以显著提高它的特定生长率。周歧存等[21]对皱纹盘鲍的研究表明维生素E可以促进其生长。杨奇慧等[22]研究发现饲料中添加适量维生素A在凡纳滨对虾生长的早期有促生长作用。但是，有关饲料中添加混合性维生素对刺参幼苗生长的影响报道较少。在该研究中，往饲料中添加不同浓度的混合性维生素复合维生素对刺参幼苗的增重率和饵料系数产生了显著性影响。与对照组相比，试验组第四组的增重率显著（P＜0．05）高于其他组，且饵料系数又处于最低水平，结果表明复合维生素的添加浓度在0．09%时刺参幼苗的生长和营养利用效率最好。该研究发现幼参增重率并未随着复合维生素添加量的增多而增加，相反，在0．13%添加量时，其增重率略小于对照组，原因可能是过高剂量的混合性维生素加重了幼参代谢负担，同样在中国明对虾[23]、斑节对虾仔虾[24]、点带石斑鱼[25]等水生动物上也发现过高剂量维生素对生长不再具有促进作用。

3．2　复合维生素对海参幼苗肠道酶活性的影响

肠道中的微生物对肠道组织的形态、代谢以及功能有很大的影响[26]，同时消化系统对有关营养物质的消化和吸收能力又紧紧依赖于肠道中微生物的种类以及数量。建立良好的肠道微生物的区系,很有助于提高生物的生产性能及其饲料利用率。近年来关于调控水产动物肠道菌群的报道有很多，例如：在对虾的饲料应用中，Sung等[27]用芽孢杆抑制了斑节对虾哈维氏弧菌（Uharveyi）的生长，降低肠道弧菌数，从而为建立正常的有益微生物区系提供了条件。Mussattoo等[28]通过用寡糖提高挥发性脂肪酸的含量从而降低肠道pH值来抑制致病菌的生长，进一步刺激双歧杆菌和乳酸杆菌的生长。这些报道说明肠道的健康不仅对促进机体生长有很好的作用，而且在控制疾病方面也有很好的疗效，特别是对于只有简单消化系统的生物来说更是尤为重要。在该试验中，通过利用不同浓度的混合性维生素复合维生素添加到饲料中饲养海参幼苗，结果显示消化酶和吸收酶活性都发生了相应的变化。

在消化酶指标中，对照组淀粉酶活性始终高于其他组，且第五组最低。这个结果可能是由于混合性维生素中的一些成分影响了蛋白酶的活性，具体的影响途径还有待进一步研究。在蛋白酶活性测定结果中，发现经过30 d、60 d的饲养蛋白酶活性的最高值分别在第四组和第六组中。这个结果表明当复合维生素的浓度在0．09%左右时能够有效地增强蛋白酶的活性。

在吸收酶指标中，在30 d时，对照组的Na+,K+－ATPase酶活性显著高于其他组，但第三组却又显著低于其他组。在60 d时对照组刺参组织中Na+,K+－ATPase吸收酶的活性较30 d初始酶活性有下降，但在60 d时第六组吸收酶活性显著高于除第四组外的其他各组（P＜0．05）而且第四组是最低的。这种变化说明复合维生素在一定程度上影响了Na+,K+－ATPase酶活性，但是相对于30 d的养殖时间，60 d的效果更好些。

3．3　复合维生素对海参幼苗抗氧化指标的影响

动物的机体内存在着大量的不饱和脂肪酸，当它们被具有强氧化能力的游离基化合物攻击时将发生过氧化反应从而生成过氧化物。此反应是一种连锁式的反应，它一旦开始就将会与周围各种细胞膜上的脂质双分子层内所包含的脂质或着其他的细胞器产生反应，从而影响有关器官的正常代谢功能或着是其受损时的自我修复功能。生物机体对脂质的过氧化反应损伤有两种防御体系：一类是非酶促反应，包括酚羟基化合物、辅酶Q、维生素和醇类等；另一类就是酶促反应，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（CAT）等。它们都可以有效清除活性氧并终止自由基链式反应，在这个抗氧化系统中CAT、SOD、AOC和MDA是主要参与抗氧化的酶。SOD主要作用于超氧自由基的歧化反应，同时在维持机体体内活性氧的动态平衡、增强吞噬细胞的防御能力等中起着关键性作用；CAT是过氧化物酶体的标志酶，约占过氧化物酶体酶总量的40%，它的作用主要是催化过氧化氢分解；T－AOC是指机体中存在的多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，他们清除体内产生的各种活性氧，阻止活性氧诱导的氧化应激（oxidative stress）的产生的能力。MDA指标直接反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度[29－32]。尽管到目前为止，有许多研究者都发现了维生素能有效地影响动物体内的抗氧化系统，但是却仍然没有一个统一的结果。Lygren等[33]的试验结果显示维生素E对大西洋蛙（Salmo sala L.）体内的抗氧化酶没有显著影响。但是，万敏等[34]研究表明饲料中添加VE能有效提高皱纹盘鲍体内的抗氧化能力。而该研究结果发现，对于刺参幼苗的抗氧化酶系统来说，复合型维生素复合维生素对这些指标都有显著性的影响。对于CAT活性来讲，在养殖30 d时后CAT的活性在第二组显著高于其他组（P＜0．05），而第五组的酶活性又达到最低值。但是经过60 d的饲养后CAT酶活的最高值出现在了第六组，最低组出现在了对照组。对于AOC酶的活性，在养殖30 d后第一组的酶活性显著高于其他组（P＜0．05），而在60 d时第五组的酶活性又是最高的且显著高于其他组（P＜0．05）。在30 d时MDA含量在第六组最高且将近是最低组的两倍，而在60 d时MDA含量在第六组达到最大值。对于SOD来讲，它的最大值都发生在第四组，而最低的酶活性却不是在同一组。产生这些结果的原因可能是由于研究的动物器官组织、饲喂方式及生态养殖条件不同[35]。但是总的来讲，随着复合维生素的添加量的变化抗氧化酶活性也都发生了改变，这与万敏等[34]在皱纹盘鲍研究中显示出的维生素能够影响抗氧化酶活性的结果是一致的。

3．4　复合维生素对海参幼苗免疫力的影响

溶菌酶是非特异性免疫系统中的重要成员之一，其作用机制主要是通过溶解细菌细胞壁中的肤聚糖成分，从而破坏细菌的细胞壁，使细胞死亡，其作用位点在N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之间的β－1,4糖苷键[36]。在海参中，溶菌酶除了有防御病害的作用外[37]，还有消化和滤食海洋细菌的作用[36]。目前，大量研究结果已表明维生素可以很显著提高多种鱼类血清中溶菌酶的活力，但是尚无关于维生素对海参幼苗溶菌酶活力影响的报道。该研究表明饲料中添加维生素可以刺激海参幼苗的非特异性细胞免疫，提高体腔液中溶菌酶的活力。其中，第四组的维生素在30 d和60 d时可以提高溶菌酶的活力，继续增加饲料中复合维生素的添加量，30 d的海参幼苗的溶菌酶活力反而有所降低。该试验结果类似于维生素对中华鲟血清中溶菌酶的影响[38]。而在试验第60 d时，试验组投喂低浓度和高浓度的复合维生素的饲料溶菌酶活力都产生了降低现象。以上试验结果说明，中低浓度的复合维生素在短期内饲喂可以迅速升高溶菌酶的活性，而高浓度的复合维生素，对免疫活力的提升效果较为缓慢。