采用电子鼻和GC-MS技术 研究慕萨莱思中挥发性成分

张 璐,张 昱,黄 英,轩 燕,侯旭杰,*

(1.塔里木大学生命科学学院,新疆阿拉尔 843300;2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室,新疆阿拉尔 843300)

“慕萨莱思”是新疆阿瓦提县流传千年极富民族特色的特有饮品,是当地少数民族酿造的一种葡萄酒类的天然果汁,被视作古代西域葡萄酒的“活化石”[1],是古代丝绸之路商贾与刀郎部落友好交往的文化产物。与现代工艺酿造的葡萄酒不同,慕萨莱思酒体的颜色略微暗淡混浊,口感质朴醇厚,具有令人愉悦的芳香气味[2]。它是将和田红等葡萄,经过压榨取汁,熬煮浓缩之后,通过自然发酵酿制而成的具有独特风格的葡萄酒。根据当地人的个人口味以及需求不同,在酿造过程中可以适当加入一些鹿茸、红枣、枸杞、藏红花、大芸等中药材,因而含有众多对人体有益的维生素、氨基酸以及多酚类化合物等,其营养丰富,具有一定的养生功效,是保健品中的极品[3-5]。

为充分利用我区的葡萄品种资源并提高慕萨莱思产品的附加值和市场竞争力,对酒中风味物质的研究尤为重要。目前慕萨莱思香气成分研究还处于起步阶段,张雅茹等[6]初步确定了慕萨莱思中的数种香气成分。在此基础上对典型慕萨莱思呈香物质进行检测,获得其典型性香气物质。电子鼻[7-8]作为新兴鉴别检测手段,能够利用数据建立模型进行定性定量研究,可以为今后对慕萨莱思酒的区分鉴别提供参考基础。

本研究以新疆阿瓦提刀郎慕萨莱思公司的慕萨莱思为样品。利用固相微萃取(SPME)和气相色谱质谱联用仪(GC-MS)以及智能感官电子鼻,对慕萨莱思酒样的呈香物质进行萃取、检测以及特征分析。筛选出慕萨莱思中主要的特征香气成分,获得其典型性香气物质,弥补单一分析方法的不全面性,分别从宏观和微观上对慕萨莱思呈香物质的差异进行相互验证,建立快速检测辨别方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

慕萨莱思不同酒精度原酒(8%vol、10%vol、11%vol,编号依次为为G1、G2、G3)、慕萨莱思成品酒(8%vol、10%vol、11%vol 为2016年酿制的葡萄味的穆萨莱思,编号依次为G4、G5、G6,G7为2015年酿制的瓶装添加大芸穆萨莱思葡萄酒) 产自新疆阿瓦提县的刀郎慕萨莱思有限公司;丙醇(纯度≥99.5%)、丙酮(纯度≥99.5%)、异丙醇(纯度≥99.5%) 色谱纯,法国Alpha-MOS公司;环己酮(纯度≥99.5%)上海东土化工进出口有限公司。

气相色谱-质谱联用仪(GC型号7890A;MS型号5975C) 美国Agilent公司;萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美国Supelco公司;FOX4000型电子鼻 法国Alpha-MOS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 电子鼻的检测条件 取1 mL(用蒸馏水稀释20倍)的慕萨莱思酒样于10 mL的电子鼻顶空专用瓶中,每个样品三次平行,整个过程都在冰上进行。吸取顶空气体2 mL注入电子鼻系统中,进行检测分析。其主要检测参数包括:空气流速为150 mL/min,数据采集时间为120 s,延滞时间为240 s。

1.2.2 GC-MS的分析条件 样品制备:准确称取1.0 g NaCl放置于10 mL的顶空瓶中,分别放入磁力搅拌转子。依次加入3 mL的慕萨莱思酒样。每个样品加入10μL浓度为2μL/mL的环己酮内标液,密封备用。选取50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头,将萃取纤维插入放有酒样的顶空瓶中,置于酒样液面20 mm的顶空空间,在300 r/min的转速下萃取20 min(在放入萃取纤维头前样品在60 ℃的恒温下预先平衡20 min,取出手柄,直接进行GC-MS分析,解析时间为3 min。

色谱条件:色谱柱:VF-WAXms(60 m×0.25 mm×0.25 μm);初始温度为60 ℃,然后以5 ℃/min的升温速度升至110 ℃,再以3 ℃/min的升温速度升至215 ℃,保持3 min;再以5 ℃/min的升温速度升至240 ℃,保持10 min。载气为氦气,流量为1.2 mL/min,进样口温度为230 ℃,检测器温度为240 ℃。

质谱条件:EI电离源,电子能量为70 eV,灯丝流量为0.20 mA。检测器电压为350V。扫描范围为50～550 amu,离子源温度为230 ℃,传输线温度270 ℃。

1.3 数据处理

采用电子鼻系统自带的软件Alpha M.O.S分析软件,对电子鼻的检测结果进行分析。将扫描的数据进行处理,主要包括数据的挖掘、校准、归一化,主成分分析(PCA)以及判别因子分析(DFA)。判别因子分析(DFA)是电子鼻最常用的模式识别方法,它是根据不同样品所属类别不同,对原始数据的向量进行线性变换,能够使不同样品很好的区分开[9]。而主成分分析(PCA)是将电子鼻不同传感器提取的总体数据进行转换和降维,对降维后的特征向量进行分类。通常若样品信息的总贡献率超过70%,认为此方法可用[10]。

GC-MS实验采用内标法,选取环己酮作为内标物对慕萨莱思香气进行定量分析,根据标准物质的浓度以及峰面积通过公式计算出香气物质的相对含量。

2 结果与分析

2.1 采用电子鼻技术对慕萨莱思进行区分

本次实验使用电子鼻系统,通过Alpha M.O.S软件建立PCA模型,如图1所示,采用PCA模式识别方法,PC1和PC2的总贡献率达98.8%,通过PCA降维后,提取的主成分包含了慕萨莱思的绝大部分信息,不同酒精度(8%、10%、11%),从左到右呈现依次递增趋势,G4、G5在左侧,G6和G7在右侧,区分指数DI值达80,区分效果较为理想[11]。如下图2所示,可以看出经过DFA模型处理后,同组的样品聚集更接近,不同组之间的距离被放大。DF1和DF2判别因子对整体信息的总贡献率达97.9%,能够代表样品的绝大部分信息,也可以很好地加以区分。

图1 现代工艺慕萨莱思的PCA模型Fig.1 PCA model of modern technology Musalais

图2 现代工艺慕萨莱思的DFA模型Fig.2 DFA model of modern technology Musalais

2.2 GC-MS挥发性成分分析

由表2可知慕萨莱思原酒及成品酒中共检测出挥发性物质164种,G1共检测出67种挥发性物质;G2共检测出47种挥发性物质;G3共检测出55种挥发性物质,G4共检测出45种挥发性物质;G5检测出54种挥发性物质;G6共检测出57种挥发性物质;G7共检测出51种挥发性物质。其中共有物质16种,包括:1-戊醇、苯乙醇、己酸、辛酸、山梨酸、癸酸、月桂酸、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、5-甲基呋喃醛、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、硬脂酸乙酯、辛酸乙酯、2,4-二叔丁基苯酚构成了慕萨莱思的主体风味物质。从原酒到成品酒中主要的挥发性物质包括醇类、酸类、酯类以及少量的醛类、酮类等。原酒中特有物质有异丁醇、异戊酸甲酯、乙酸异戊酯、苯甲醛、月桂酸乙酯、乙烯基-2-甲氧基苯酚。成品酒中特有的挥发性物质主要有:2,4-二叔丁基苯酚、丁二酸单乙酯、肉豆蔻酸、肉豆蔻酸乙酯、异戊醇、十二醛二甲缩醛。原酒中乙酸异戊酯具有香蕉及水果香;月桂酸乙酯具有花果的芳香气味;苯甲醛具有苦杏仁、樱桃及坚果香。成品酒中肉豆蔻酸、肉豆蔻酸乙酯具有椰子、油脂的香味;异戊醇具有酒精味、成熟果实挥发性气味。由此可知慕萨莱思原酒及成品酒中主要香气以花香水果香丰富、具有浓厚的醇香味及焦糖香,此外还有坚果、杏仁味及脂肪香,香气较为丰富,典型性强。

表2 慕萨莱思挥发性成分分析结果Table 2 Result of Musalaisi volatile components

续表

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2.3 原酒及成品酒挥发性成分含量对比

如下图3可知,含量较高的物质主要是1-戊醇、苯乙醇等一些高级醇类。G1原酒中还检测出香叶醇、松油醇这两种醇属于萜烯类化合物,主要来源于葡萄原料的品种香。其中含量较高的酯类主要是:辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、棕榈酸乙酯等。三个发酵罐中的原酒中酯类物质的种类和含量存在着一定的差异。G1原酒中的总酯类含量相对较高,G3原酒中酯类物质含量较低。可能是三个发酵罐中的原酒的陈酿时间不同,G2原酒陈酿的时间相对较短,一般陈酿时间越长酯类物质会通过酯化作用的缓慢增加。G1中酸类含量最高,其中含量较高的辛酸、癸酸、月桂酸、山梨酸均高于G2和G3。其中G1原酒中(E)-反-2-辛烯醛含量较高为6.71 mg/L,主要来源于葡萄品种,属于品种香,具有令人愉快的绿叶清香和水果香气。G1中的2,4-二叔丁基苯酚含量明显高于G2和G3,其主要来源于一类香气。

图3 不同慕萨莱思原酒挥发性成分相对含量比较Fig.3 Comparison of relative contents of volatile components in different wines

如下图4所示,G6和G7酒样中醇类物质、酯类物质含量要高于G4和G5。由此可以发现,四种慕萨莱思中醇类、酯类和酸类以及少量的醛类和酮类是其主要的挥发性成分,其中醇类在慕萨莱思酒中占有及其重要的位置,苯乙醇和异戊醇的含量相对较高。G7酒样中还检测出特有α-萜品烯、丁香酚等一些含量相对较低的物质,α-萜品烯具有类似树脂的气味,而丁香酚具有甘甜的花香和辛香,赋予了慕萨莱思更为丰富的挥发性。此外酮类和醛类物质在慕萨莱思中所占比例虽然很小,但在香气的感官质量上是形成该产品典型香气特征的主要挥发性成分,在慕萨莱思产品的特征描述和感官评价上具有重要意义。

图4 不同酒精度慕萨莱思挥发性成分相对含量比较Fig.4 Different alcohol Musalaisi volatile components relative content

2.4 主成分分析法分析慕萨莱思酒样中主要挥发性成分

利用SPSS 20.0软件对慕萨莱思发性成分进行主成分分析,在所有的主成分构成中,信息主要集中在前三个成分中,其累计贡献率达到99.9%,主成分个数由累计贡献率达到85%以上为依据。第一主成分的贡献率为62.179%,第二主成分的贡献率为21.602%,第三主成分的贡献率为16.215%,由此可知,这三个主成分包含慕萨莱思挥发性成分的大部分信息,有限的摒除了不重要因素的影响,由表3可知,第一主成分中因子系数较高的有苯乙醇、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、月桂酸、5-甲基呋喃醛,其中苯乙醇的载荷最大,是第一主成分的最重要的影响因子;对第二主成分影响较大的因子是乙酸乙酯、辛酸、癸酸等,对第三主成分影响较大的因子是辛酸乙酯、己酸等。通过SPSS软件分析可知慕萨莱思中主要的挥发性物质为醇类和酯类,部分醛类的存在对慕萨莱思挥发性成分有负面影响(见图5),确定出慕萨莱思主要的挥发性成分有苯乙醇、1-戊醇、己酸、辛酸、月桂酸、癸酸、乙酸乙酯、苯乙酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯等。

表3 成分矩阵Table 3 Component matrix

图5 旋转空间中的成分图Fig.5 Composition diagram rotating in space

通过本次实验可以发现,原酒中苯乙醇的平均含量为66.761 mg/L,成品酒中苯乙醇的平均含量达108.031 mg/L,1-戊醇的平均含量在原酒和成品酒中变化不大;在原酒和成品酒中含量较高的酸类物质主要有辛酸、山梨酸、癸酸。其中癸酸和辛酸在成品酒中的含量要高于发酵罐的原酒,而山梨酸在成品酒中的平均含量78.987 mg/L要远高于原酒中山梨酸的平均含量0.691 mg/L,极大可能是成品酒中添加山梨酸钾防腐剂所导致山梨酸的含量明显增加。

醇类物质是慕萨莱思的主要挥发性物质,带有芳香气味。其中对挥发性成分影响较大主要是高级醇:苯乙醇、1-戊醇、异戊醇等。苯乙醇赋予了慕萨莱思蜂蜜香、玫瑰花香等宜人的香气,醇类中最重要的是戊醇,由发酵所产生,1-戊醇和异戊醇赋予了慕萨莱思果香及酒香风味。当这些杂醇的含量高于300 mg/L时,会有辛辣刺激性气味,G4和G5总醇的含量超过了300 mg/L,在口感上辛辣味较重。酯类物质,通常是在发酵过程中产生的二类香气,有时也是陈酿过程中产生的三类香气,主要是酵母在生物合成以及陈酿过程中发生酯化作用所产生。在慕萨莱思中酯类物质的种类相当丰富,主要包括:乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、棕榈酸乙酯、辛酸乙酯等。丁二酸二乙酯主要表现出微弱令人愉快的风味;辛酸乙酯表现出香皂味、蜡烛味;苯乙酸乙酯和乙酸乙酯具有果香味[11]。多种酯类化合物的共同作用会产生较大的风味指数。酸类物质在慕萨莱思中主要来自于葡萄的成熟和酒精发酵过程,影响较大的酸类物质主要有:己酸、辛酸、山梨酸、癸酸。己酸具有类似甜味,辛酸具有脂肪味,酸干酪味。而含量较高的山梨酸少量来源于葡萄原汁中,其余可能在成品酒中人为的添加所致。醛类和酮类物质在慕萨莱思中的含量比很低,但在构成慕萨莱思整体风味中起着非常重要的作用。

2.5 GC-MS与电子鼻实验结果的相关关系

为了探究GC-MS与电子鼻数据的相关性,本研究利用偏最小二乘法(PLS)建立两种仪器数据的数学模型,利用模型中决定系数R2的大小来判断两种仪器在测定上的相关性[12]。本实验选取慕萨莱思成品酒(G4、G5、G6、G7)为对象,为了便于数据处理的方便把GC-MS得到不同挥发性物质进行高一级种属的划分。总共划分为4大类物质:醇类,酯类,酸类和醛类,并将不同挥发性物质的相对含量按照划分种属进行合并。这样的划分是数据具有代表性,并且更利于清晰PLS模型的建立。具体划分结果和各种物质相对含量见下表4,根据PLS模型的原理,将电子鼻的十八根传感器进行归类,根据电子鼻对不同挥发性物质的敏感性,归为四大类。以电子鼻传感器数据为自变量,以GC-MS得到的四大类化合物的相对含量为因变量来建立模型,根据决定系数R2的大小来判断模型的可靠性和两种仪器的相关性。R2数值越高,证明两种仪器得到的数据相关性越高,模型可靠性和适用性越高。

表4 GC-MS 检测几大类挥发性化合物的相对含量Table 4 The relative contents of several categories of volatile compounds based on GC-MS datas

下图6,PLS模型图反映了醇类、酸类、酯类和醛类四大类物质的实际含量与模型的预测含量之间的关系。G4、G5、G6、G7四个酒样的R2值依次为0.93、0.94、0.92、0.93。可以看到四个方程的R2均大于 90.0%,并且 PLS 模型的实际值和预测值表现良好。说明 GC-MS 与电子鼻实验数据在区分不同慕萨莱思成品酒方面具有高度的相关性。

图6 电子鼻和GC-MS得到的挥发性物质实际值与预测值的PLS模型结果Fig.6 The PLS results for the actual and predicted responses of the content of volatile compounds based on E-nose and GC-MS datas

3 结论

通过对不同酒精度的成品酒进行电子鼻检测,结果表明电子鼻可以有效地区分以上酒种。PCA模型的得分在80～100之间被认为是比较好的,表明对样品能够很好的区分开来。DFA模型主要用来预测未知样品,结合使用PCA模型和DFA模型可以有效建立区分辨别不同种类的慕萨莱思。本文中建立基于电子鼻技术对慕萨莱思以及葡萄浓缩汁快速的区分鉴别方法是可行的。

通过主成分分析可知,慕萨莱思中醇类、酯类以及酸类物质是最主要的挥发性组成成分。此外还有酮类、醛类、酚类以及萜烯类等其他挥发性物质含量相对较低,但也共同参与构成慕萨莱思香气物质的感官特异性,对整体挥发性成分的贡献也非常重要。对慕萨莱思挥发性成分贡献较大的物质有苯乙醇、苯乙酸乙酯、己酸、丁二酸二乙酯等。

GC-MS的定量分析结果表明,不同种类的慕萨莱思均能引起葡萄酒中不同香气浓度的差异,从而引起慕萨莱思之间挥发性成分的差异,该差异能够被电子鼻识别区分。GC-MS 与电子鼻数据结果建立的 PLS 模型决定系数均大于 90.0%,具有很好的相关性。采用具有“模糊评价”属性的电子鼻技术结合具有“精准检测特性”的GC-MS分析方法可以对不同酒精度的慕萨莱思进行区分。