知母多糖对链脲佐菌素 诱导糖尿病大鼠的降血糖作用

侯红瑞,陈 玲,孙国勇,李炳辉

(1.茂名职业技术学院,广东茂名 525000;2.华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州 510640)

糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病群,高血糖由于胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗引起,长期慢性高血糖诱发脂肪和蛋白代谢紊乱,继而引起一系列视网膜、肾脏、神经、心血管系统的并发症,对人类健康、寿命和生活质量构成严重威胁[1]。虽然临床治疗药物种类不少,但大多为化学药物(西药)[2]。西药在控制血糖方面疗效值得肯定,但长期使用存在许多副作用,如恶心、厌食、肝肾损伤等,且价格昂贵。中医治疗糖尿病也有相当长的历史,传统中医把糖尿病称作“消渴症”,《黄帝内经》及《金匮要略》就有关于糖尿病发病症状及机理的记载[3]。中药对于改善机体状况,减轻发病症状,尤其在治疗糖尿病并发症方面有着稳定的疗效,并且与西药相比,作用温和持久,毒性和不良反应少[4]。因此研究和开发具有良好疗效的中药降血糖产品具有广阔的发展前景。

知母为百合科植物知母[AnemarrhenaasphodeloidesBge.(AA)]的干燥根茎,具有清热泻火、生津润燥,止渴除烦等功效[5],有悠久的降血糖应用历史,从传统治疗糖尿病的中药方剂“玉液汤”到现代中成药人知降糖胶囊、降糖舒胶囊等均含有知母。知母化学成分多样而复杂,目前发现的有皂昔、双苯吡酮类、多糖类、有机酸类等[6-9]。研究表明知母中的皂昔、多糖均具有抗糖尿病的作用[10-11],尤其是知母多糖在降血糖和抗氧化性方面效果显著。目前已有相关文献报道,但是目前文献研究知母多糖降血糖的报道中知母多糖均是水提、醇提或醇沉法制备而得,所得知母多糖成分复杂、纯度低,其抗氧化及降血糖的有效部位较模糊[12-14]。

本文对知母根茎水提、醇沉,得到知母粗多糖后,除去蛋白质,再利用无机陶瓷膜进行膜分离得到分子量为30～100 kDa的知母多糖。本课题组前期对该知母多糖进行生物活性研究中发现,其具有良好的体外抗氧化性尤其在清除·OH方面效果突出,并对胰岛素受体和底物磷酸化水平起负调控作用的蛋白络氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)活性有很高抑制率(达69.39%)[15]。为进一步深入探讨分子量为30～100 kDa知母多糖的药效物质基础及降血糖作用机制,本文用链脲佐菌素(STZ)诱导建立实验性SD大鼠糖尿病模型[16],研究该知母多糖对STZ型糖尿病SD大鼠降血糖、降血脂效果,为知母深层次药用开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

知母 购自广州致信中药饮片厂,产地河北,批号081101,为知母根茎切片;链脲佐菌素(AR) 美国Sigma公司;二甲双胍片 河北天成药业有限公司;总胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒 中生北控生物科技有限公司;胰岛素测定试剂盒 美国ADL公司。

ALPHA2-4真空冷冻干燥机 德国Christ公司;Labscale超滤系统 美国Milipore公司;3K30超速冷冻离心机 德国Sigma公司;BX51TRF荧光显微镜 日本Olympus公司;血糖测定仪(稳豪倍易型) 美国强生公司。

SPF级SD大鼠 40只,雄性,体重130±3克/只,由广东省医学动物实验中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 知母多糖的提取分离 知母根茎切片后在沸水中提取4 h,提取3 次,收集提取液,减压浓缩至适当体积后加4 倍体积无水乙醇放置过夜,4000 r/min离心,真空冷冻干燥得知母多糖粗提物,4 ℃密封干燥保存备用。

配制5%的知母多糖粗提液置于-20 ℃冰箱中冷冻过夜后室温缓慢融化,高速离心(8000 r/min)重复4次,直至没有残渣,用Sevage法去除蛋白至无游离蛋白为止,Sevage法去除蛋白后的知母多糖在室温,0.2 MPa压力下经0.3 μm孔径的无机陶瓷膜微滤[17]。所得滤液在0.35 MPa压力下用30、100 kDa的膜包进行膜分离,收集分子量为30～100 kDa知母多糖组分,采用苯酚-硫酸法[18]测得分子量介于3～100 kDa的组分中知母多糖含量占总组分质量的75%。

1.2.2 STZ型糖尿病SD大鼠动物模型的建立 将40只SD大鼠分成4 组,10 只/组,在动物房内温度为22 ℃和相对湿度为60%的条件下饲养。大鼠适应环境3 d后对大鼠进行糖尿病造模。STZ用0.1 mol/L,pH4.5的柠檬酸钠缓冲液新鲜配制。大鼠禁食不禁水12 h之后,STZ 90 mg/kg给大鼠尾静脉一次注射造模。恢复进食72 h后尾静脉取血测血糖,以血糖值在16～24 mmol/L的大鼠为成模动物[19]。根据成模的血糖值将大鼠随机分成三组,每组10 只,分别为高血糖模型组、二甲双胍组、知母多糖组。随机取10 只未造模正常大鼠作为正常对照组。正常对照组及模型组均灌胃给予等量生理盐水,二甲双胍组灌胃给予二甲双胍300 mg/kg,知母多糖组灌胃给予知母多糖300 mg/kg,每天给药1次,连续给药4周。

1.2.3 实验指标测定 连续给药4周,每周末禁食不禁水12 h,称重后,取尾部静脉血测量空腹血糖,并根据公式(1)计算血糖抑制率。给药4周后,禁食不禁水12 h,颈椎脱臼处死大鼠采血2 mL,3000 r/min离心分离血清,用试剂盒测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),低密度脂蛋白胆固醇(LDC-C)。采用放射性免疫法测定血清胰岛素(FINS),根据公式(2)计算胰岛素抵抗指数(IRI)[20],用以评价外周胰岛素的抵抗程度。

血糖抑制率(%)=(给药前空腹血糖值-给药后空腹)/给药前空腹血糖值

式(1)

式(2)

1.2.4 糖尿病SD大鼠胰腺病理组织学观察 颈椎脱臼处死大鼠后,迅速摘取完整的胰腺组织,置于冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液并仔细分离多余的脂肪组织。取相同部位的胰腺组织,放入10%的中性福尔马林溶液固定,每例均进行苏木素-伊红(HE)染色和石蜡包埋,切片在光学显微镜下观察[21]。

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 知母多糖对糖尿病SD大鼠体重的影响

由表1可知,给药前各组SD大鼠体重无显著差异(p>0.05);给药第4周,与正常对照组比较,模型组的SD大鼠体重极显著下降(p<0.01),表现出糖尿病的明显特征。二甲双胍组在给药后的前2周体重出现持续下降,给药3周之后体重开始恢复,与模型组比较有极显著差异(p<0.01),说明降血糖药物有减轻糖尿病SD大鼠消瘦症状的作用。知母多糖组的SD大鼠体重在前3周也出现逐渐下降的趋势,与模型组比较,下降趋势缓慢,给药3周后有显著差异(p<0.05),经4周治疗后,体重恢复至造模开始时体重。表明,知母多糖能减缓糖尿病SD大鼠体重负增长趋势,促进SD大鼠体重正增长,对糖尿病SD大鼠体重下降有一定的缓解作用。

表1 各实验组SD大鼠体重的变化Table 1 The body weight change of SD rats from each

2.2 知母多糖对糖尿病SD大鼠空腹血糖的影响

造模成功后的SD大鼠空腹血糖值与正常组相比,极显著高于正常值(p<0.01),4 周给药期间,模型组的血糖值较为稳定,没有出现自我恢复的现象,二甲双胍组和知母多糖组SD大鼠的空腹血糖值均显著下降,与模型组比较差异极显著(p<0.01),结果见表2。4周给药后,二甲双胍组血糖值逐渐降低至大鼠正常水平(<7.5 mmol/L),血糖抑制率达到69.3%,说明二甲双胍处理对糖尿病SD大鼠血糖有很好的控制作用;知母多糖组SD大鼠的血糖值呈逐渐下降趋势,降低程度较二甲双胍组有所减缓,至4周后降低至接近大鼠正常血糖水平,与模型组相比有极显著差异(p<0.01),血糖抑制率达到62.4%,略低于二甲双胍组。说明知母多糖对STZ诱导的糖尿病大鼠具有较好的降血糖效果。

表2 知母多糖对STZ致糖尿病SD大鼠空腹血糖的影响Table 2 Effects of AM on FBG of streptozotocin-induced diabetic

2.3 知母多糖对糖尿病SD大鼠血脂的影响

灌胃4周后,取血清测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。结果见表3。

表3 知母多糖对STZ致糖尿病SD大鼠血脂的影响Table 3 Effects of AM on blood-lipid of streptozotocin-induced diabetic

由表3可看出,与正常对照组比较,模型组的TC、TG、LDL-C含量均高于正常对照组,HDL-C低于正常对照组,且存在极显著性差异(p<0.01),血清TG、TC含量是判定高血脂症的重要指标,说明STZ致糖尿病SD大鼠出现脂代谢紊乱,有高血脂表现。给药4周后,知母多糖组SD大鼠血清中的TC水平与模型组相比极显著降低(p<0.01),TG水平显著降低(p<0.05),说明知母多糖具有降低血清TC、TG水平的作用。有研究表明,HDL-C含量越低,则冠心病的发病率越高,是冠心病的负危险因素[22]。与模型组比较,知母多糖组SD大鼠血清中的HDL-C水平极显著升高(p<0.01),LDL-C水平极显著降低(p<0.01),说明知母多糖具有升高HDL-C水平,降低LDL-C水平的作用。二甲双胍组与模型组比较,SD大鼠血清中的TG水平未降低反而极显著升高(p<0.01),TC、HDL-C、LDL-C指标无显著差异(p>0.05)。表明知母多糖可降低糖尿病SD大鼠的总胆固醇(TC)和甘油三脂(TG),升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),对STZ致糖尿病引起的高血脂症有预防及治疗作用。

2.4 知母多糖对糖尿病SD大鼠空腹胰岛素的影响

胰岛素是人体胰腺β细胞分泌的调节体内糖代谢的内分泌激素,也是身体内主要的降血糖激素。胰岛素抵抗是胰岛素作用的器官、组织,如肝脏、肌肉、脂肪等体内周围组织对胰岛素的敏感性降低,对胰岛素不敏感,反应性降低或消失,外周组织如肌肉、脂肪对胰岛素促进葡萄糖摄取的作用发生了抵抗,从而引起一系列病理变化与临床疾病。降低患者的胰岛素抵抗,改善胰岛素敏感性,可延缓糖尿病发展。

从表4可以看出,STZ致糖尿病SD大鼠模型组与正常对照组相比胰岛素水平显著升高(p<0.05),且胰岛素抵抗指数(IRI)极显著升高(p<0.01),出现明显胰岛素抵抗。给药4周后,与模型组比较,二甲双胍组和知母多糖组SD大鼠血清胰岛素显著降低(p<0.05),IRI极显著降低(p<0.01),胰岛素抵抗明显改善。说明知母多糖能有效改善STZ致糖尿病SD大鼠的胰岛素抵抗,且效果与二甲双胍相当,通过改善胰岛素抵抗,实现对胰腺β细胞功能的保护来治疗糖尿病。

表4 知母多糖对STZ致糖尿病SD 大鼠胰岛素的影响Table 4 Effects of AM on FINs of streptozotocin-induced diabetic

2.5 知母多糖对糖尿病SD大鼠胰腺组织学的影响

如图1所示,对胰腺组织形态的观察结果表明,正常对照组胰岛为圆形或椭圆形的细胞团,细胞核大小均匀,分散于胰腺腺泡之间,胰岛中细胞数量较多,细胞分布均匀,排列规整,结构清晰,与周围胰腺组织边界清晰可辨。模型组胰岛结构紊乱,形态不规则,组织疏松,外分泌腺边界不太清晰,胰岛内分泌细胞分布不均,细胞数目减少。知母多糖组胰岛结构较清晰,边缘整齐,细胞分布比较均匀,组织紧凑,胰岛细胞数目相对于模型组增多但仍显著少于正常对照组。说明知母多糖可改善糖尿病大鼠胰腺萎缩情况,减轻STZ对SD大鼠胰岛细胞的选择性损伤,对糖尿病大鼠胰腺有较好的保护,并能增加胰岛细胞数量、提高胰岛细胞功能。

图1 知母多糖对STZ致糖尿病SD 大鼠胰岛组织形态影响(×50)Fig.1 Effect of AM on the islet morphology of streptozotocin-induced diabetic rats (hematoxylin-eosin stain,×50)注:a.正常对照组;b.高血糖模型组;c.知母多糖组。

3 结论

本文采用链脲佐菌素(STZ)诱导建立实验性SD大鼠糖尿病模型,探究分子量30～100 kDa知母多糖组分的降血糖机制。结果表明,给药治疗4周后,与模型组相比,分子量30～100 kDa知母多糖可有效地降低糖尿病SD大鼠血糖值,血糖抑制率达到62.4%,且SD大鼠体重呈现升高趋势;糖尿病SD大鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量降低,HDL-C含量升高,改善了糖尿病SD大鼠脂代谢紊乱;可显著降低SD大鼠血清胰岛素和IRI,对胰岛素抵抗改善明显;HE染色观察后发现知母多糖可减轻STZ对SD大鼠胰岛细胞的选择性损伤,对被特异性破坏后胰岛细胞有修复作用。结合本课题组前期对分子量30～100 kDa知母多糖组分在体外抗氧化和抑制PTP-1B活性的能力研究[15]可知,知母多糖的降血糖作用主要是通过提高抗氧化能力、改善胰岛素抵抗和修复受损胰岛细胞组织,实现对胰腺β细胞功能保护,刺激胰岛细胞增加胰岛素的分泌,提高外周组织对胰岛素的敏感性,从而起到降低血糖的作用。