钙对半夏生理特性及光合生理的影响

2018-07-11,,,

浙江理工大学学报(自然科学版) 2018年4期

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(浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018)

0　引　言

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)为天南星科药用植物，其块茎经炮制干燥可入药，性温味辛，具有降逆止呕、燥湿化痰、消痞散结的功效，是我国传统治痰止吐中药[1]。Ca2+是半夏生长必需的营养元素之一，植物体内Ca2+正常浓度维持在0.1%～5.0%，因此保证植物体内正常的钙浓度才能使维持植物体的生长发育[2]。正常情况下，缺钙是很少见的，但是在植物生长发育过程中，高盐、高温或低温、土壤水分不良和根系活力不高等不良环境因素的影响都会导致植物钙素吸收不足。在逆境环境中，植物体需氧代谢会加快，从而产生一系列过多的活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)，损害细胞膜，加剧细胞氧化衰老，破坏植物体内微平衡[3]。植物抗逆境生理生化等分子调控机制发挥自我保护作用，产生一系列清除逆境胁迫产生的过多ROS的保护酶，如过氧化物酶(Peroxidase, POD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)等[4]。逆境对植物的伤害通过膜脂的过氧化生成过氧化物，从而对植株产生伤害，如丙二醛(Malondialdehyde, MDA)等[5]。因此深入探究钙离子对半夏的生理特性的影响，对于不良环境下半夏的抗逆性的提高能提供科学依据。

植物对逆境的应答反应有Ca2+参与，胞外Ca2+要穿过质膜进入胞内起作用[6]。Gong等[7]研究发现，Ca2+浓度处理对玉米幼苗的耐热性有明显增强作用，植物细胞感受并传导逆境刺激信号的明显变化是胞质中Ca2+浓度发生变化。李灿雯等[8]认为植物的抗氧化系统通过调节Ca2+浓度来提高其抗逆性，而且Ca2+对提高叶绿体的活性具有重要作用。Ca2+在光合电子传递发挥重要作用，不仅可以增强能量在捕光色素或反应中心之间的传递，还可以使放氧核心复合物的荧光发射强度增加[9]。此外，钙离子能促进PSII潜在活性保持较高水平[10]，因此适当提高植株的钙水平可以促进叶片的光合作用。

为了获得半夏钙肥的最适施用浓度范围，本文通过研究在不同浓度的氯化钙溶液作用下半夏叶片生理和代谢响应的差异，探讨Ca2+对半夏生理酶活性、光合作用参数、叶绿素荧光参数等生理生化因素的影响，为半夏的种植优化、提高品质提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　实验材料

本实验材料为三叶半夏(P.ternata)，选择大小相近、形态一致的块茎为繁殖材料，材料取自湖北襄阳地区。采用盆栽(14 cm×15 cm)栽种，用蛭石作栽培基质，Hoagland-Arnon基本营养液浇施每盆基质，每盆定植15株，置于实验室遮阳棚内。Hoagland-Arnon完全营养液配方作为大量元素和微量元素配方，其中用KNO3代替Ca(NO3)2，pH值调至6.0。当每盆半夏植株叶片完全展开时，大致高8～10 cm左右，在基本营养液的基础上，用CaCl2作外源钙处理，设计6个不同水平(0、200、400、600、800 mg/L和1000 mg/L)浓度处理，每个处理3盆。每隔5 d喷施200 mL于叶面，直至半夏倒苗，在全苗期各处理中每盆挑选10株生长良好，长势一致的成熟植株，取其中间叶片进行光合指标和生理指标测定，重复3次。

1.2　相关指标测定方法

1.2.1生理酶活指标测定

SOD活性根据梁爱华等[11]氮蓝四唑光氧化还原法测定，POD活性根据袁庆华等[12]愈创木酚显色法测定，紫外吸收法测定CAT活性参考文献[13]，MDA含量参照高俊凤[5]硫代巴比妥酸显色法测定。

1.2.2叶绿素含量测定

取半夏新鲜叶片，将叶片清洗干净，除去叶片中脉部分并剪碎混匀。称取0.2 g混匀的新鲜叶片，称3份，放入研钵中，加少量液氮磨碎，再加入2 mL 80%丙酮，研磨成匀浆，装入2 mL离心管，静置至组织变白。再过滤到25 mL试管中，用丙酮定容至25 mL，采用分光光度计法测定叶绿素含量，在721分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)测定溶液在波长663、645 nm下的吸光度[14]，用80%丙酮溶液为空白对照，测定吸光度值的计算按照参考文献[15]，叶绿素a和叶绿素b含量可用公式表示为：

Ca=12.7×OD663-2.69×OD645,

Cb=22.9×OD645-4.68×OD663,

其中：C为叶绿体色素的浓度，mg/L；OD为吸光度值；12.70、2.69、22.90和4.68系数为比吸收系数；Fw为鲜重，g；VT为提取液总体积，mL；n为稀释倍数。

1.2.3叶绿素荧光参数测定

夜晚将待测样品放入暗室暗处理30 min，利用超便携式调制叶绿素荧光仪(Mini-PAM，上海泽泉科技股份有限公司)按照预先编好的程序测定，选取生长良好的叶片测定电子传递速率(Electron transfer rate,ETR)、光化学猝灭系数(Photochemical quenching,qP)、光合量子产量(Photosynthetic quantum yield,Yield)和非光化学猝灭系数(Non-photochemical quenching,qN)等，选取长势一致的叶片重复3次实验，取3次数据的平均值分析。

1.2.4光合作用参数测定

挑选天气晴朗的晴天，于上午9:00—12:00，利用Li-6400便携式光合仪(上海泽泉科技股份有限公司)测定叶片的净光合速率(Photosynthesis,Pn)、蒸腾速率(Transpiration rate,Tr)、气孔导度(Stomatal conductance,Gs)和胞间二氧化碳浓度(Intercellular carbon dioxide concentration,Ci)等参数，设定仪器温度30 ℃，光量子通量密度为800 μmol/(m2·s)，CO2浓度380 μmol/mol，选取长势一致的叶片重复3次实验，取3次数据的平均值分析。

1.2.5数据分析

本实验数据均以平均值±标准误进行表示，平均值之间的统计学意义是由Duncan的多个范围的测试评估(p≤0.05作为显著性)。所有数据统计分析和方差检验用Excel 2013和SPSS 17.0，并用Origin 8.0进行绘图。

2　结果与分析

2.1　不同钙浓度对叶片生理酶活性的影响

图1(a)为不同Ca2+浓度对半夏叶片SOD活性的影响，结果表明：Ca2+对半夏叶片中SOD活性影响显著；在Ca2+浓度为0、200、1 000 mg/L时，SOD活性均较低。由图1(a)可知，钙浓度的升高导致半夏叶片中SOD活性随之呈先升后降的趋势，600 mg/L浓度时最高，但是当Ca2+浓度为1 000 mg/L时SOD活性却较低。这表明钙离子浓度并不是越高越好，高浓度的钙盐处理会抑制酶的活性，只有适宜的Ca2+浓度能提高半夏叶片中SOD的活性。图1(b)为不同Ca2+浓度对半夏叶片POD活性的影响，图1(b)显示，Ca2+处理的实验组，叶片中POD活性明显升高，呈现出先升高后降低的趋势。POD活性在Ca2+浓度为600mg/L时达到最大，但过高浓度的Ca2+会抑制半夏叶片内的POD活性。图1(c)为不同Ca2+浓度对半夏叶片CAT活性的影响，结果表明：半夏叶片中CAT活性随着Ca2+浓度的升高，呈现先升高后下降的趋势，Ca2+对半夏叶片CAT活性影响明显。由图1(c)可知，当Ca2+浓度为600 mg/L时，CAT活性最高。图1(d)为不同Ca2+浓度对半夏叶片MDA含量的影响，由图1(d)可知，MDA的含量随着Ca2+浓度的增加而呈现先下降后增加的趋势，Ca2+处理明显降低半夏叶片中MDA含量，其中MDA含量在Ca2+浓度为600 mg/L时最低，但是高浓度的钙处理MDA的含量升高，表明高浓度的钙处理不能改善膜脂过氧化，适宜浓度的Ca2+处理可以降低半夏叶片中MDA的含量，降低膜氧化程度，稳定生物膜[16]，提高半夏的抗逆性。

图1　不同Ca2+浓度对叶片生理酶活性的影响

2.2　不同钙浓度对叶片叶绿素含量的影响

图2为不同钙处理下叶绿素含量的变化，由图2可知Ca2+浓度为200～1000 mg/L处理与对照相比均提高叶绿素a、b含量及叶绿素总量，当Ca2+浓度为600 mg/L时，叶绿素含量明显高于其他处理组，因此适当提高Ca2+浓度明显提高叶绿素a/叶绿素b比值，叶绿素a/叶绿素b比值高低反映植株维持光合系统的协调性的强弱，是植物对逆境适应的一种表现[17]。

图2　不同Ca2+浓度对叶片叶绿素含量的影响

2.3　不同钙浓度对叶片叶绿素荧光参数的影响

图3为不同钙处理下叶片荧光参数变化，由图可知不同钙处理的叶绿素荧光参数存在比较明显的差异。由图3(a)可知，Ca2+处理可提高半夏叶片的实际光合效率，电子传递速率(ETR)随光照强度(PAR)的增加均呈上升趋势,600 mg/L的钙处理明显高于其他处理组。图3(b)显示，非光化学淬灭系数(qN)随着钙处理有所下降，至600 mg/L时达最低，qN值的降低说明更多的光能被用于CO2固定；光化学猝灭系数(qP)随光强的变化规律如图3(c)，在不同钙处理下，qP在低光强条件下降低很快，随着光强的增加，qP降低速率显著减缓，由图3(c)可知600 mg/L浓度下qP值较好。Yield表示PSII的实际光化学效率，图3(d)表明随着光强的升高，600 mg/L钙处理下降速度最慢，且都高于其他实验组。

图3　不同Ca2+浓度对叶片叶绿素荧光参数的影响

2.4　不同钙浓度对叶片光合参数的影响

表1为不同钙浓度对叶片光合参数的影响，由表1可知钙处理却使Pn升高，600 mg/L浓度处理是对照0 mg/L浓度的2.27倍，对照的胞间CO2最高，400、600、800 mg/L钙处理对比对照组Ci下降显著，与Ci相反，一定浓度Ca2+处理显著降低气孔导度，Ca2+处理下气孔较对照有一定程度的关闭，钙处理在高温下提高光合速率并非气孔因素，反而能对高温下的叶片有一定的保护作用；低浓度的Ca2+处理与对照相比差异显著，高浓度的Ca2+处理降低气孔导度，蒸腾作用也有所降低，在600 mg/L浓度Ca2+处理下，显著提高叶片的净光合速率，胞间CO2浓度明显降低，同时蒸腾作用显著增强。

表1　不同Ca2+浓度对叶片光合参数的影响

注：同系列数据后的不同字母分别表示在0.05水平上显著差异。

3　讨　论

一定浓度的钙处理能提高半夏的SOD活性，但过高浓度钙处理反而抑制SOD活性，并且600 mg/L浓度的钙处理能促进超氧化物歧化酶的活性；POD是普遍存在于植物体内，并且活性较高的一种重要保护酶，主要清除细胞内的H2O2，参与以H2O2或有机过氧化物为还原剂的各种氧化反应，与植物的呼吸作用、光合作用、生长素的氧化以及木质素的形成密切相关[5]，通过氧化还原反应将H2O2还原为H2O，从而使细胞组织组织免受破坏。此外POD活性随植物生长发育进程以及环境条件的改变而变化，因此POD活性可以反应植物体内的代谢及抗逆性的变化。在本实验中，400～600 mg/L浓度范围内，半夏的POD活性维持一个较高水平，600 mg/L浓度处理最好；CAT是植物体内重要的保护酶之一，是以一种铁卟啉为辅基的酶类清除剂，能协同SOD、POD迅速清除代谢中产生的H2O2，缓解膜脂过氧化[24]。MDA是膜脂过氧化重要的产物之一，其含量反映膜脂过氧化的程度[25]，常结合蛋白质导致蛋白质偶联从而损害细胞膜，其含量反映细胞膜脂过氧化程度，因此可以通过测定MDA含量了解膜系统受损程度。本文中，Ca2+处理降低半夏叶片MDA的积累，MDA含量越低表示植株生长旺盛，实验结果显示600 mg/L浓度的钙处理下MDA含量较低，有助于缓解膜脂过氧化。

叶绿素荧光参数在植物生化过程中的变化可以与ATP合成、CO2固定、电子传递等过程紧密联系起来，反应植物叶片光化学反应效率的高低、吸收光能的多少，激发能传递的强弱等光合作用一系列的原初反应过程，直接反映植物生长状况[26]。叶绿素含量是反映植物光合能力的重要指标之一，有研究发现光合色素容易受到活性氧的破坏，Ca2+可通过调节抗氧化系统清除活性氧来保护[27]。叶绿素a/叶绿素b比值反映类囊体膜垛叠程度，对同一植物而言，叶绿素a/叶绿素b比值直接反映植物对光量子的有效吸收、传递和利用，以及叶片光化学效率的高低[28]。本研究结果表明，600 mg/L浓度处理增强了半夏叶片光合色素的稳定性，Ca2+处理提高a/b比值，进一步证实Ca2+可能通过结合膜表面上的磷酸盐、磷酸酯以及蛋白质的羟基保持膜结构及功能的稳定性[29]。叶绿体类囊体膜上的光化学反应中心的光能转换效率随着钙处理浓度的升高而升高，但钙处理浓度过高又会抑制光合转换效率；qP指由光合作用引起的荧光淬灭，反映植物光合活性的高低以及PSⅡ反应中心的开放程度，其中PSⅡ天线色素吸收光能后，用于光合作用的电子传递[30]，qN反映植物热耗散的能力的变化，600 mg/L浓度Ca2+处理下qN较低；qP在600 mg/L浓度处理下却较高，这表明适宜的钙处理会增大PSⅡ反应中心开放程度，增强PSⅡ电子传递活性，同时PSII反应中心光电子传递能量占所吸收光能的比例明显增强，ETR也有所增强[31]。

光合作用效率的高低直接决定植物生长发育，探讨影响植物光合速率的因素对促进植物生长发育至关重要[32]。胡龙娇等[33]在研究光质对半夏组培苗的生理特性和光合特性影响时发现气孔因素和非气孔因素都对叶片光合速率有影响，叶肉细胞气体扩散阻抗，CO2的溶解度，Rubiso对CO2的亲和力都是影响叶片光合速率的关键因素[34]。叶片光合速率是由气孔因素和非气孔因素两个方面共同影响，温度对叶片光合速率影响显著。已有研究表明，依据Pn，Ci，Gs的变化方向可以判断光合速率变化的影响因素，在高温环境下光合作用受到抑制并非气孔因素，可能是叶片气孔关闭导致叶肉细胞气体扩散阻抗增加[35]，CO2的溶解度下降，叶肉细胞同化能力降低，Rubiso酶对CO2的亲和力降低，光合中心关键成分的热稳性降低[36]。杨卫星等[9]认为Ca2+处理能增加叶片气孔限制值，可以维持气孔正常开闭的能力。本文中随着Ca2+浓度提高，Gs、Tr降低，这表明Ca2+在一定程度上降低半夏的气孔导度，使气孔有所关闭；Pn却升高，表明Ca2+提高光合速率并非气孔因素；600 mg/L浓度Ca2+处理下，Pn显著增强，伴随着Ci降低和Tr增强，这表明该浓度处理下能显著提高半夏光合作用。