经胸彩色多普勒超声无创性评估心脏肥大和纤维化小鼠模型的冠状动脉血流储备

周 宁，Philip F.Haines，段云友，王 滔

（1南方医科大学深圳医院超声科，广东深圳518100；2美国布朗大学，美国罗德岛州02912；3空军军医大学唐都医院超声科，陕西西安710038；4美国宾夕法尼亚大学医学院心血管研究所，美国宾夕法尼亚州19104）

0 引言

冠状动脉造影（coronary angiography，CAG）可以直接评估冠状动脉病变、狭窄程度，并且同时完成介入治疗。虽然作为冠状动脉狭窄诊断的“金标准”，但它只能得到冠状动脉的解剖学评价，不能评价血流动力学指标以及反映冠状动脉功能，并且是有创性检查，因此其应用受到限制。冠状动脉血流储备（coro⁃nary flow reserve，CFR）是根据血流量增加的需求增加冠状动脉血流量的能力，它是最大充血血流量（H）与冠状动脉静息（B）血流量的比值。CFR的测定可以评估冠状动脉狭窄程度，并可评估冠状动脉微循环的完整性和生理功能［1］。因此临床医生可以对整体疾病进行更合理的诊断和治疗，而不仅仅是判断冠状动脉解剖学狭窄的程度。

高血压心脏纤维化患者的心脏功能与CFR下降有关［2］。关于冠状动脉血流量和CFR的研究已经在临床开发中，但由于技术原因，在动物模型中很少有研究报道。我们通过研究测量血管紧张素II（Ang II）和去氧肾上腺素（PE）诱导的心肌肥厚和纤维化小鼠的CFR，旨在获得准确和可重复的小鼠冠状动脉血流储备的测量方法。我们希望通过本实验为临床相关的心脏疾病和药物治疗效果评估提供一种无创、可重复的动物模型和实验方法。

1 材料和方法

1.1 动物 用 Ang II［0.432 mg／（kg·d）］和 PE［50 mg／（kg·d）］处理 C57BL／6J小鼠以诱导心脏肥大和纤维化2周作为实验组。空白对照组不作处理。实验组为10只Ang II＋PE处理的小鼠，对照组共8只，体质量均为25～35 g。所有使用的方案均符合实验动物管理评估和认证协会制定的指导方针，并获得宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。

1.2 动物实验方法 仰卧于加热平台上的小鼠用

1%～2.5%异氟醚气体和氧气的混合物吸入麻醉。使用直肠温度探针监测小鼠的体温，并在整个过程中使用红外加热灯使其体温保持在（37.0±0.5）℃。 通过加热平台上的电极垫监测ECG信号，两点心电图连接到小鼠的右上和左下肢。心电信号可在超声心动图上实时显示。ECG信号使得心脏收缩期和舒张期更容易被识别。使用化学脱毛剂（Nair）去除小鼠胸毛以减少超声衰减。涂抹温热的超声耦合剂的超声波探头（MS550D）置于小鼠胸部。

使用配备有MS550D换能器的高分辨率（40 MHz）Vevo 2100 成像系统（VisualSonics Inc.，Toronto，Canada）进行经胸二维（2D）和彩色多普勒超声心动图研究。

1.3 经胸超声心动图 从短轴切面和胸骨旁长轴切面获得乳头肌水平的二维图像。然后使用超声仪自带图像分析软件（Vevo 2100，1.6，VisualSonic）下载和分析超声图像。测量至少三个心动周期，并对测量结果进行平均。基于2D的M⁃模式成像从胸骨旁左心室短轴切面测量左心室（LV）舒张末期（LVIDd）和收缩末期内径（LVID）以及射血分数（EF）和LV质量。LV收缩功能通过LV EF和缩短率（FS，%）根据以下公式估算：FS（%）＝ ［（LVIDd－LVIDs）／LVIDd］×100%。

脉冲多普勒超声心动图在心尖四腔切面进行。将取样容积放置在二尖瓣叶顶端的水平处，并且调整以测得二尖瓣多普勒流信号的最高舒张早期流速峰值。舒张早期峰值速度（E，A）及其比值（E／A）由二尖瓣多普勒波形得出。

1.4 冠状动脉彩色多普勒超声成像 除了用于评价心脏功能的超声心动图成像的标准切面外，我们采用了一系列改进并优化的彩色多普勒成像技术显示左冠状动脉（left coronary artery，LCA）。通过优化图像，血流与超声波束之间的角度保持在20°以下。使用脉冲多普勒测量冠状动脉流速。测量的平均值是从三个连续的心动周期计算的。测量平均舒张流速、峰值舒张流速和速度时间积分（velocity⁃time integral，VTI）。

使用彩色多普勒成像，LCA的近端部分可在三种不同切面中显示。它们是LV长轴切面、LV短轴切面和改良的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面是最好的（图1）。因为它具有更高的可重复性，并且LCA的显示率更高。在我们获得了经典的四腔心切面之后，只需将探头稍向小鼠的头部移动，在显示肺动脉之前，就可以得到改良的五腔心切面，我们可以看到LCA的近端部分。只有在这种切面下，我们才可以获得声束与血流之间的角度小于20°的多普勒信号。而在LV短轴切面，我们通常可以看到LCA主干的二维结构，但有时因为角度问题无法获得其内的血流信号。在LV长轴切面，由于角度问题（表1），LCA的VTI、峰值速度和平均速度的测量结果均低于我们从改良的五腔心切面获得的结果。因此，我们选择改良的五腔心切面作为LCA的最终测量切面。

图1 左冠状动脉三个检查切面

表1 左室长轴切面及改良的五腔心切面下基础状态及充血状态下左冠状动脉测值

1.5 冠状动脉CFR检测 通过面罩吸入3%的异氟烷诱导麻醉小鼠，之后保持在2%的浓度。将异氟醚浓度降至1%，在3 min后稳定时获取多普勒信号并将其存储在计算机中，将所测数据冠脉流量作为基线水平（B）。然后异氟醚水平增加到2.5%，以增加冠脉流量，3 min后多普勒波形稳定，存储多普勒频谱，所测数据作为充血后水平（H）。按照前述方法分别获得基线及充血状态下LCA的多普勒频谱。我们建议在整个过程中使用控制台系统而不是用手来控制探头。只有这样，才能较一致且稳定地获得LCA的多普勒频谱。如果在3 min内用手握住探头，则很难将探头保持在同一点。值得注意的是，当将异氟醚减少至1%时，有时候小鼠会有清醒的趋势，可能会有移动，这时需要调整探头的位置以获得LCA图像。

1.6 统计分析 所有数值均以±s表示。使用t检验分析组间差异。对于所有分析（Prism 5，GraphPad⁃Inc，San Diego，CA），P＜0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验组小鼠心肌肥大及纤维化 Ang II＋PE处理的小鼠与对照组相比发生中度心肌肥厚，小鼠心肌重量增加，EF正常，舒张功能障碍表现为二尖瓣 E减低（P＜0.05，表2）。

表2 在未处理的空白对照组小鼠和Ang II＋PE处理的小鼠心脏相关测量值

2.2 小鼠左冠状动脉CFR测量结果 左冠状动脉近端血流在改良的五腔心切面可以较好地被测量（图2）。Ang II＋PE处理的小鼠在充血状态下舒张期峰值速度（PDV），平均速度和VTI降低。CFR（PDV，平均速度和VTI的H／B比）显著降低（表3）。

图2 左冠状动脉血流频谱

3 讨论

由于冠状动脉很小，位于胸腔深处并且由于它们附着于心外膜表面而处于恒定运动状态，因此超声波对于冠状动脉血流的无创测量是困难的。本研究证明，无创左冠状动脉血流和CFR评估在不使用药物诱导冠脉血流储备发生变化的小鼠中是可行的。使用高频超声心动图技术可以较容易地测量小鼠LCA近端血流。

表3 在未处理的空白对照组小鼠和Ang II＋PE处理的小鼠中基础状态和充血状态下的左冠状动脉CFR

左主干冠状动脉多普勒频谱的典型表现是舒张期主导的血流频谱。在实验中我们发现冠状动脉血流频谱可以在三种不同的切面中获得，它们分别是左室长轴切面、短轴切面和改进的五腔心切面。相比之下，改良的五腔心切面被认为是测量左主干冠状动脉的最佳切面。在改良的五腔心切面观察中获得的冠状动脉血流速度的测量结果高于其他两个切面中的测量结果，并且显示率也较高。在长轴和短轴切面中，声束与血流之间的角度通常超过20°，导致血流速度测量误差；特别是在短轴切面左冠状动脉起始段大部分时间内几乎与声束相互垂直时，只能观察到二维的LCA结构图像，但无法获得血流图像；即使得到LCA的多普勒频谱，但得到的LCA的速度和VTI要比它在改良的五腔心切面中得到的要低。在改良的五腔心切面，LCA血流与超声波束之间的角度基本上可以小于20°，并且显示率可以达到100%。

CFR是最大冠状动脉充血流量与基线血流的比值，使用经胸多普勒超声心动图（transthoracic doppler echocardiography，TTDE）评估，已用于临床评估冠状动脉狭窄严重程度［1］和检测心肌微血管功能障碍［3］。临床TTDE CFR方案也适用于小鼠实验，以评估动脉粥样硬化小鼠的左冠状动脉最小管腔直径［4］以及心肌炎模型中的微血管功能障碍［5］。Wikström等［6］使用经胸超声心动图评估腺苷诱导的小鼠冠状动脉血流储备。他们发现，CFR似乎是用于评估小鼠体内冠状动脉功能的更可靠的方法。在该项研究中，他们使用腺苷来获得冠状动脉血流的充血状态。

给予特定的冠状血管舒张剂如腺苷［7－8］是评估冠状动脉血流储备所必需的，已经应用于临床实验中，但这在静脉更难以插管并且耐受剂量和容量更小的小鼠中更成问题。有人偶然地发现，最广泛使用的麻醉剂之一——异氟烷气体在较高浓度下也是冠状血管扩张剂［9］。使用吸入性冠状血管舒张剂，如果有效并且耐受性良好，将大大简化对小鼠冠状动脉血流储备的检测，并使该方法真正无创。2010年，Hart⁃ley等［10］发现，通过将异氟醚气体麻醉的浓度从1%改变为2.5%，冠状动脉血流速度可以从基线（B）增加至充血（H）水平，并且H水平与腺苷诱导的相似或更高。他们在实验中将探头放置在小鼠左侧胸部，并将取样容积放置于深度2.5 mm处，朝向左主冠状动脉的起点。冠状动脉血流信号多普勒频谱在显示器上通过流向为朝向探头的舒张早期峰值血流进行识别。在该研究中，他们通过移动探头发现冠状动脉血流波形谱时识别冠状动脉，而不是直接观察冠状动脉血流，因此结果可能会出现偏差。在本研究中，我们吸取以往研究的优点，使用不同的异氟醚浓度来获得B和H水平，而不使用药理学试剂；并通过比较，选择了LCA测量的最佳切面，可以直接观察到冠状动脉，获得较为准确的冠状动脉血流参数。证实了通过经胸超声心动图这种无创的检查手段获得LCA起始段的血流频谱，且该方法的可行性和可重复性较好。

有研究［11］表明，临床患者的冠状动脉CFR显示率高达95%～100%，具有良好的可行性和可重复性。在本研究中，冠状动脉左支起始段CFR在改良的五腔心切面观察中的检测成功率在小鼠中也提高到了100%，并且与报道的一致。小鼠的静脉难以插管并且耐受剂量和容量更小，因此，以往对于使用临床使用腺苷之类药物诱导检测冠状动脉在小鼠动物模型中较难实现。通过本实验避免了静脉使用腺苷等药物诱导，且在实验室大部分的小鼠模型的麻醉方法均为使用吸入用异氟醚麻醉，通过吸入面罩调节剂量在实验中也十分方便。在本实验中，我们成功检测到，使用Ang II＋PE处理的心肌肥大及纤维化小鼠的左冠状动脉CFR明显减低。

4 结论

在不使用药物的情况下，无创冠状动脉血流储备评估在小鼠实验模型中是可行的。通过本实验的验证，可以建立临床相关的心脏疾病小鼠动物模型，并通过经胸彩色多普勒超声对动物模型的冠状动脉血流储备进行监测，为疾病的诊断、药物或其他治疗方法的效果评估提供一种无创、可重复的实验方法。

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