耐盐米曲霉育种及其在广式酱油酿造中的应用

梁亮 滑欢欢 符姜燕 郑二帅

摘 要：通过对耐盐米曲霉育种及其在广式醬油酿造中应用的研究，结果表明，沪酿3.042米曲霉菌株经复合诱变，中性蛋白酶活力基本稳定在7569U/g，约是出发菌株的1.9倍。突变菌株HN01传代15次，均未检出黄曲霉毒素，食品安全性能稳定。在制曲过程中，添加食盐诱导，提高了突变菌株的中性蛋白酶的耐盐性，经HN01菌种酿造出的天然油氨基酸态氮较对照样提高了8.6%。

关键词：广式酱油；酿造；耐盐米曲霉

中图分类号 TS264.21 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）11-0011-03

Abstract：Through the research on salt-tolerant Aspergillus oryzae breeding and its application in Cantonese-style soy sauce brewing， the complex mutation of Aspergillus oryzae 3.042 strain showed that the neutral protease activity was basically stable at 7569 U/g， about 1.9 times that of the original strain. The mutant strain HN01 was passaged 15 times and no aflatoxin was detected. The food safety performance was stable. In the process of koji-making， addition of salt induces the salt-tolerance of the neutral protease of the mutant strain to be improved. Therefore， the amino acid nitrogen of the natural oil brewed by the HN01 strain is increased by 8.6% compared with the control sample.

Key words：Cantonese-style soy sauce；Brewing；Salt-tolerant Aspregillus oryzae

1 引言

对于高盐稀态酱油发酵工艺，其生产过程可分为大曲阶段和酱醪阶段2个阶段。大曲阶段是米曲霉合成和分泌蛋白酶的时期，是决定酱油氨基态氮生成的前提。酱醪阶段是蛋白酶水解大豆蛋白生成氨基态氮的主要时期，是决定酱油品质的关键。温度和水分是大曲阶段的主要工艺参数，会显著影响米曲霉的生长和产酶。温度和盐度是酱醪阶段的最主要的工艺参数，不仅会影响蛋白酶的活性，还会影响其稳定性。研究米曲霉固态发酵过程中温度和水分对菌体的生长及酶合成的规律，可以提高大曲阶段蛋白酶的产量。研究蛋白酶在高盐环境下的反应动力学和失活动力学，可以为酱醪发酵工艺的优化及耐高盐蛋白酶添加策略提供理论依据，进一步提高酱油品质并缩短发酵周期。

2 材料与方法

2.1 试验主要材料 酿造酱油生产原料：黄豆、面粉、麸皮，从市场采购。沪酿3.042米曲霉菌种：由上海市酿造科学研究所提供。亚硝基胍、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钙试剂：由广州化学试剂厂提供。

2.2 主要设备 超净工作台、NK式蒸煮锅、发酵池、培养箱、3m3发酵罐。

2.3 试验方法

2.3.1 亚硝基胍与紫外线复合诱变及菌株初筛 （1）单孢子悬液制备：取28℃培养3d的斜面菌种，用50mL无菌水洗下孢子，置于三角瓶28℃、300r/min振荡30min，使孢子分散，用滴管加半滴吐温80，调整密度至106个/mL。（2）亚硝基胍诱变：吸取1mL单孢子悬液加入1mL 0.4mg/mL亚硝基胍溶液，使其终质量浓度为0.2mg/mL。28℃振荡反应30min。诱变结束后加入10mL、pH8.0磷酸缓冲液，4500r/min离心10min终止反应。（3）紫外线诱变：将上一步诱变完毕的孢子在紫外灯下30cm处照射处理20min。诱变结束后加入10mL、pH8.0磷酸缓冲液，4500r/min离心10min终止反应。（4）初筛：适当稀释诱变液，取适当稀释液涂布于耐盐性中性蛋白酶初筛培养基，28℃培养72h后计算致死率，并用透明圈法筛选蛋白酶酶解圈增大最大的菌株。耐盐性中性蛋白酶初筛培养基配方：脱脂奶粉4g、磷酸二氢钾0.36g、磷酸氢二钠1.07g、氯化锌0.04g、氯化钙0.002g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.02g、氯化钠100g、胰蛋白胨0.04g、琼脂10g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。

2.3.2 诱变菌种复筛、传代及遗传稳定性、食品安全性研究 （1）复筛：将初筛所得K值较大的8株菌落转接至斜面并培养成熟后，各转接1个三角瓶，于32℃条件下培养72h后检测中性蛋白酶活力。复筛培养基配方：豆粕500g、麸皮500g、自来水800mL，拌匀后装量为100g湿料/L三角瓶。（2）遗传稳定性试验：将经过多次复筛后得到的菌株连续传代15次，每次传代后筛选出生长较好的菌株接种到复筛培养基中培养，然后测定其中性蛋白酶活力。（3）食品安全性测定：将突变株的三角瓶发酵产物进行黄曲霉毒素总量检测。

2.3.3 食盐诱导制曲工艺的研究 （1）食盐对成曲酶活力的影响：根据已优化的制曲工艺，在混合料中分别添加0%、0.5%、1%、1.5%、2%的食盐，检测成曲中性蛋白酶活力。（2）无机盐对成曲酶活力的影响：根据已优化的制曲工艺，在混合料中分别添加K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4，其中FeSO4、MnSO4的添加量为0.02%，其余6种为0.2%，其他条件不变，检测中性蛋白酶酶活力。

2.3.4 新菌株在酱油酿造中的应用 按照广式天然油酿造工艺验证突变株和出发菌株对天然油氨基酸态氮的影响，具体工艺参数见表1。

3 结果与分析

3.1 亚硝基胍与紫外线复合诱变及菌株初筛

3.1.1 诱变致死率 计算公式如下：

致死率（%）=（未经处理组菌落总数-处理后菌落总数致死率）/未经处理组菌落总数×100

由表2可知，经历亚硝基胍与紫外线复合诱变后，出发菌种致死率为89.1%。

3.1.2 菌种初筛结果 在初筛培养基上分别测量菌株的透明圈直径和菌落直径，根据K值（K值为透明圈直径/菌落直径）筛选出8株K值较大菌株，如表3所示。由表3可知，初筛出的诱变菌种的K值均高于原始菌株沪酿3.042的K值，故下一步将对这8株菌株进行发酵复筛，测定中性蛋白酶酶活力。

3.2 诱变菌种复筛、传代及遗传稳定性、食品安全性研究

3.2.1 发酵复筛结果 透明圈直径与菌落直径相比可以作为产酶能力大小的指标。将初筛所得K值较大的8株菌落转接至斜面并培养成熟后，各转接1个三角瓶，于32℃条件下培养72h后检测中性蛋白酶活力，结果见图1。从图1中可以得出，1株高产蛋白酶活力的菌株米曲霉HN01，其蛋白酶活力为7569U/g，约是出发菌株的1.9倍。

3.2.2 遗传稳定性试验 将最终筛选的米曲霉HN01菌株连续传代15次，分别测定其中性蛋白酶活力，结果如表4所示。从表4中可以得出，其中性蛋白酶活力一直稳定在以上，表明该变异菌株具有良好的遗传稳定性。从表4中可以得出，其中性蛋白酶活力一直稳定在7500U/g以上，表明该变异菌株具有良好的遗传稳定性。

3.2.3 食品安全遺传稳定性 将突变株在表4中的三角瓶发酵产物进行黄曲霉毒素总量的检测，所传的15代均为未检出黄曲霉毒素。

3.3 食盐诱导制曲工艺的研究

3.3.1 食盐对成曲酶活力的影响 由图2可知，随着食盐添加量的增加，耐盐性中性蛋白酶活力呈现先升高后降低的趋势，食盐添加量小于1%时，对酶系产生的抑制较小，可有效诱导并提升耐盐性蛋白酶活力。超过此添加量时，食盐对酶系的抑制作用增大，不利与后期发酵中氨基酸态氮的生成。综上所述，食盐的最适添加量为1%，此时耐盐性中性蛋白酶活力可达2738U/g。

3.3.2 无机盐对成曲酶活力的影响 在混合料中分别添加K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、Na2HPO4、CaCl2、FeSO4、MnSO4，其中FeSO4、MnSO4的添加量为0.02%，其余6种为0.2%，其它条件不变，检测中性蛋白酶酶活力，结果如图3所示。由图3可知，Ca2+对产酶有一定的抑制作用，这是因为中性蛋白酶是一种金属酶，它的辅酶是Zn2+，在培养基中添加Ca2+会使它取代一部分活性部位的Zn2+，从而使中性蛋白酶酶活力降低。而KH2PO4和Na2HPO4能使酶活力明显升高。它们2种都是磷酸盐，对微生物的生长非常重要。添加浓度为0.2%的KH2PO4和Na2HPO4会对产酶有一定作用，其他的无机盐对米曲霉产酶并没有太大影响。所以我们选择KH2PO4和Na2HPO4作为添加的无机盐。

3.4 突变株HN01在酱油酿造中的应用 按照广式天然油酿造工艺，对比不同菌种对天然油理化指标的影响。由表5可知，米曲霉沪酿3.042经诱变后，提高中性酶活力，食盐诱导制曲工艺，增强了米曲霉分泌中性蛋白酶的耐盐性，因此经HN01菌种发酵出的天然油氨基酸与对照样相比提高了8.6%。

4 结论

沪酿3.042米曲霉菌株经复合诱变，中性蛋白酶活力基本稳定在7569U/g左右，约是出发菌株的1.9倍。突变菌株HN01传代15次，均未检出黄曲霉毒素，食品安全性能稳定。在制曲过程中，添加食盐诱导，提高了突变菌株的中性蛋白酶的耐盐性，经突变株HN01菌种发酵出的天然油氨基酸较对照样提高了8.6%。

参考文献

[1]刘丽萍，刘丽华.米曲霉研究进展与应用[J].中国调味品，2008（4）：28-32.

[2]周传云，聂明，万佳蓉.从酱油生产用种粉中选育优良米曲霉菌种[J].食品与发酵工业，2004（4）：79-82.

[3]杨俊豪，陈宝英，吴培群，等.酱油曲霉蛋白酶活力的提高[J].工业微生物，1994，24（1）：1-6.

[4]党敏娜，傅亮，欧仕益.盐浓度对不同米曲霉所产生中性蛋白酶活力的影响[J].中国调味品，2005，317（7）：18-19.

[5]雷肇祖，钱志良，章键.工业菌种改良述评[J].工业微生物，2004，34（1）：39-51.

（责编：张宏民）