基于ImageJ软件的香樟千粒重的测量及其应用

钟永达 周燕玲 李彦强 刘立盘 刘淑娟 杨爱红 刘腾云 余发新

摘 要：研究香樟种子千粒重的变异水平，不仅有助于香樟的遗传改良，而且有助于香樟产业的发展。现有基于人工计数的香樟种子千粒重测量方法费时费力，而且容易出现误差，尤其不适合大样本的处理。该研究利用扫描仪获取标准图形，通过ImageJ软件自动计数，称重后得到千粒重，并与人工计数法进行了比较；利用该方法对江西境内具有地理代表性和古樟分布广泛的10个种源种子的千粒重进行了测定，分析了其种源及家系间的变异水平。结果表明：图像测定法能快速、准确对香樟种子进行计数，大大提高了千粒重测定的速度；江西局部种源香樟种子千粒重之间的变异主要来自于种源间，群体平均多样性指数为1.10，遗传多样性水平较低，且千粒重性状受地理气候因子影响较小。

关键词：香樟；千粒重；ImageJ软件；种源；变异

中图分类号 S792 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0082-04

Application of ImageJ Analysis Software in Measuring 1000-Seed Weight of Cinnamomum

camphora

Zhong Yongda et al.

（The Key Laboratory of Horticultural Plant Genetic and Improvement of Jiangxi，Institute of Biological Resources，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang 330096，China）

Abstract：The variation research on camphor 1000-seed weight will both contribute to the improvement of genetic breeding and promote the development of camphor industry.However，the measurement of camphor 1000-seed weight based on artificial counting are time-consuming，laborious and prone to error，especially not suitable for large sample processing.In our research，we use the scanner to obtain the standard graphics，counting automatically by ImageJ software，calculating 1000-seed wright after weighing，and compared it with the artificial counting method.Then the camphor 1000-seed weight from Jiangxi provenance and its variation were analyzed.The results showed that scanner with ImageJ software provides a rapid and accurate way to the camphor seeds counting.1000-seed weight variations among camphor trees from Jiangxi mainly come from the provenance，the average diversity index is 1.10 which suggested small genetic variation level among populations，and less affected by climatic factors.

Key words：Cinnamomum camphora；1000-seed weight；ImageJ analysis software；Provenance；Variation

植物種子形态是植物生活史循环中的核心特征之一[1]，深刻影响着植物的种子寿命、种子发芽率、实生苗建成、物种更新能力和种群分布格局等各个方面[2-6]。种子千粒重是林木分类学上的一种重要性状，在林木遗传研究上具有重要价值[7]，更是育苗中确定播种量的直接依据之一。传统的千粒重测定方法是人工计数后天平称重，经过换算获得千粒重，但人工计数费时费力，不但效率低而且误差较大。种子自动数粒仪的出现一定程度上解决了千粒重的自动测定问题[7-9]，但由于种子在穿过检测区时会有叠影现象，易造成计数失误[9]，而且对于大样本量而言，即使利用数粒机仍很费时。因此，如何快速准确进行种子计数成为千粒重性状研究的关键。

香樟[Cinnamomum camphora （L.）Presl]是我国珍贵材用和经济树种，与楠、梓、桐合称为江南四大名木，为国家二级重点保护野生植物[10]。主要分布在我国长江以南的江西、浙江、福建、台湾等东南沿海省份，朝鲜、越南、日本等地亦有分布，其他各国有引种栽培[11]。江西全省各地遍布古香樟，现在保存的古樟林有300余处，被誉为“樟树之乡”的安福县400年以上的香樟有8700多株，1000年以上的有200多株[12]。中国开发利用香樟的历史悠久，在距今约7000年的河姆渡遗址中就发现有樟木的使用。香樟种子不仅是香精香料的重要原料，而且还可以制备轻质生物柴油、表面活性剂以及高级洗衣皂、香皂等，果皮还可入药[3]。因此，开展香樟种子千粒重表型变异的研究，不仅有助于香樟的遗传改良研究，也有助于其经济价值的开发。任华东等通过分析我国香樟47个种源的种子百粒重认为，种子百粒重在产地间存在显著差异。东南部的江西、福建及浙江南部种源的种子普遍较大，江西井冈山、上饶和遂川三地的香樟种子平均百粒重为18.55g，而云南及广东种源的种子相对较小。但此次研究中每个种源为10～12棵母树混合采种，未进行家系研究[13]。李芳等对7个省41个种源的香樟种子的千粒重进行了研究，结果表明樟树种子千粒重在种源间差异显著，与经度存极显著正相关[14]。本实验室以材用香樟为目标，收集了12个种源，每种源随机选取3个家系进行了研究，发现千粒重在种源和家系间的遗传变异达到极显著水平[15]。上述香樟种子千粒重的测量大都基于传统方法进行，费时费力，尤其不适用于大样本大数据量的处理。近年来，随着数码照相技术以及计算机图像处理软件发展，为快速简便进行香樟种子计数提供了可能。例如美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，USA）开发的用于科研和临床中的医学影像分析的ImageJ软件[16]，通过图像处理和分析，可以轻松实现血细胞和脑皮层细胞的计数，与人工计数相比，效率提高10倍以上[17，18]。本研究利用扫描仪结合ImageJ软件对香樟种子进行计数，天平称重，计算得到香樟种子千粒重，所有分析均可以在个人电脑上完成。在此基础上，选取江西境内具有地理代表性和古樟分布广泛的10个种源，100株香樟为材料，对其种子千粒重大小变异进行了研究，为香樟等林木种子千粒重的大样本量测定提供高效技术方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2014年11月底，分别选取江西省科学院院内、江西宁都和安徽安庆3个种源各1棵成年期香樟，采摘紫黑色种子带回实验室，清水浸泡2～3d使果皮吸水软化，用细沙搓揉除净果皮果肉，洗净阴干后利用2种方法分别测定千粒重。另外选取江西境内具有地理代表性和古樟分布广泛的10个种源地，每种源10个家系测量千粒重（表1）。

1.2 图像测定法

1.2.1 扫描拍照 选取待测香樟种子150～200粒，平铺于白布上，种子之间隔开一定距离。在白布边上摆一把有刻度的直尺，作为“标尺”用于在该扫描模式下像素值与距离值的转换。采用紫光高清拍摄仪Unispro G760（或其他扫描仪）进行扫描，保存文件。

1.2.2 图像处理 运行ImageJ软件，Open导入照片。选取直尺上已知距离，打开Analyze/Set Scale，设定参数。Distance in Pixels为扫描时的分辨率；Known Distance为选取的直尺距离；Pixel Aspect Ratio可理解为放大倍数，由于扫描时多为100%扫描，此处设置为1.0；Unit of Length为已知距离的长度单位，点击OK进入下一步骤。打开Image/type/8-bit和Image/Adjust/Threshold，将待测种子彩色图像转换成黑白二值图像，种子自动用黑色进行填充。最后，打开Analyze文件下的Analyze Particles进行计数，设置Size（mm2）（10-100）和Circularity（0.50～1.00）去除假阳性。点击OK，输出结果。该结果可以保存也可直接复制粘贴至Excel表中进行处理。

1.2.3 千粒重换算 用精度为0.001g天平称重，根据ImageJ软件测定的粒数，换算成千粒重。

1.3 人工计数测定法 测定方法按照国家标准GB 2772-1999进行。从待测定的香樟种子中随机选取8个重复，每个重复100粒，分别称重。计算变异系数，如果变异系数不超过4，则将各重复换算成千粒重并取平均值。

1.4 数据分析 对上述测定的数据进行统计分析。用Excel2010进行调查数据录入和整理，并计算各性状的平均值（X）、标准差（σ）、变异系数（CV）等；根据平均数和标准差的结果将每个性状分为6级，1级，

2 结果与分析

2.1 香樟种子千粒重测定方法的比较 用人工计数法和图像测定法分别测量香樟种子的千粒重（表2），结果显示，2种方法在测定香樟种子千粒重时差异不显著，而且图像测定法变异系数更小，说明图像测定法是可行的，且更稳定。

2.2 江西10个种源香樟种子千粒重表型变异 利用图像测定法对江西10个种源、100株香樟种子的千粒重进行了测定。结果表明（表3），婺源种源千粒重平均值最小，仅为110.83g；吉安种源最大，为152.68g。千粒重最大的家系来自湖口，为205.62g；千粒重最小的家系来自永修，仅为73.95g。变异系數介于13.29%～25.18%，最大的是湖口种源，最小的是安义种源。10个群体的遗传多样性指数介于0.80～1.50，其中最高的为湖口群体，最低的是全南群体，平均遗传多样性指数为1.10，表现出较低的遗传多样性水平。

双因素方差分析结果表明（表4），千粒重性状在各种源间的差异达到极显著水平，家系间差异不显著，说明香樟种子千粒重的差异主要存在于种源间。

2.3 聚类分析 对香樟各种源的种子大小进行聚类分析，其结果见图1。从图1可以看出，10个种源可以分为2大类群，安福、瑞昌、全南、靖安、永修和婺源聚为一大类；吉安、湖口、遂川和安义聚为一类。聚类结果与地理种源没有直接关系，说明香樟种子千粒重与经纬度没有直接相关性且可能是由微效多基因控制。

2.4 江西10个种源香樟种子千粒重对地理气候因子的响应 通过相关性分析结果表明（表5），香樟种子千粒重与经度、纬度、海拔呈负相关，与年均气温正相关，但都未达到显著水平，说明江西省内种源香樟种子千粒重对地理气候因子的响应较小。

3 结论与讨论

树木种子大小影响着树木的生物学和生态学等一系列特征[1]。目前，学者们对林木种子的千粒重变异情况进行了广泛研究，但大多采用人工计数的方法进行测定[13-15，20-23]。ImageJ软件已被广泛应用于医学细胞的自动计数中，并展现出相当的准确性和简便性[24]。本研究利用扫描仪或其他拍照工具获得标准图像，利用ImageJ软件的分析功能可以实现种子粒数的自动测定。与人工计数测定法相比，本方法在保证准确性的前提下（表2），大大缩短了计数时间，并减少了人工计数可能带来的误差。根据实验对比，用图像处理法测量100份每份100～200粒香樟种子千粒重，1个人6h内可以完成，如果用人工计数，大概需要18h，效率提高3倍以上。不仅如此，通过ImageJ软件分析，还可以对种子大小性状进行测量，进行种子大小的全面分析。所有得到的数据均将自动保存在Excel表中，减少了数据录入时间。

长期的地理隔离造成的基因漂移，可能导致同一个树种的不同地理种源在种内出现变异[14]。香樟是一个古老的树种，早在石炭纪已有香樟植物的化石。在长期的自然演替和进化过程中，形成了江西不同的地理种源间种子千粒重的差异。本研究利用图像测定法，对江西省境内具有地理代表性且古香樟分布广泛的10个种源、100个家系的种子千粒重进行了测定和表型变异分析。结果表明，江西10个种源香樟种子千粒重之间的变异主要来自于种源间，家系间差异不显著（表4）。本实验室前期利用材用香樟群体为材料也得到了相似的结论[15]，与李芳[14]、任华东[13]等人的研究结果相似，说明在相似的地理气候条件下，遗传是决定种子重量的决定因素。然而，本研究中种源内家系间的差异未达到显著水平，且群体内的遗传多样性水平较低（表3，表4），暗示了江西省内各个种源在长期的地理隔离过程中，形成了遗传的有效隔离。相关研究表明，种子千粒重的地理梯度变异是一个受生境水分、温度、海拔等多因素控制的复杂过程，是植物对不同生境下“胁迫耐受假说”和“资源限制假说”的权衡选择的结果[25]。李芳和任华东等研究均认为，香樟种子的千粒重与经度呈显著正相关，随着经度的增加，种子越重，即东部种源种子千粒重往往较大[13，14]。而其他一些研究结果认为，植物种子的重量与纬度呈显著负相关，即纬度越高，种子越轻[26]。然而，本研究中相关性分析表明，江西省内种源种子千粒重与经纬度、海拔、年均气温等相关性均不显著（表5），聚类分析结果也表明种子千粒重与经纬度没有直接相关性（图1），这可能是本研究仅针对江西省内局部种源，经度大都在东经114°～116°，取样范围比较集中所致。香樟种子千粒重的地理梯度变异情况仍需进一步深入研究。

本研究通过扫描仪获取标准图像，利用ImageJ软件自动输出种子粒数，无需编程就可实现大量样品的处理。将图像测定法应用于江西省内种源大样本量香樟种子千粒重的变异研究，验证了该方法的有效性。相比传统的人工计数法，该方法快速简便，且稳定有效，有利于大样本量香樟种子千粒重的研究。

参考文献

[1]ANGELA T.MOLES，DAVID D.ACKERLY，CAMPBELL O.WEBB，et al.A brief history of seed size[J].Science，2005，307（5709）：576-580.

[2]張忠.树木种子大小与实生苗生长物候现象的关系[J].国外林业，1995，25（4）：1-4.

[3]麦静，杨志玲，杨旭，等.厚朴种子大小变异对萌发及幼苗生长的影响[J].种子，2015，34（4）：32-36，42.

[4]张蕾，张春辉，吕俊平，等.青藏高原东缘31种常见杂草种子萌发特性及其与种子大小的关系[J].生态学杂志，2011，30（10）：2115-2121.

[5]陈延松，周守标，欧祖兰，等.安徽万佛山自然保护区常见植物种子大小变异[J].植物生态学报，2013，36（8）：739-746.

[6]GRIME J，JEFFREY D.Seedling establishment in vertical gradients of sunlight[J].J Ecol，1965，53（3）：641-642.

[7]蒋孟.种子千粒重自动测定仪研制成功[J].林业科技通讯，1986（6）.

[8]张云鹤，乔晓军，王成，等.种子自动数粒仪[J].自动化技术与应用，2005，24（3）：59-61.

[9]宋秖苏，华娇，蓝景针，等.转盘斜刮式光电自动数粒仪设计[J].农业机械学报，2011，42（11）：89-92.

[10]国家林业局.国家重点保护野生植物名录（第一批）.第4号令[M].北京：国家林业局，农业部，1999.

[11]戴宝合.野生植物资源学[M].北京：农业出版社，1993.

[12]黎祖尧，陈尚钘，金志农，等.江西樟树[M].南昌：江西科学技术出版社，2015.

[13]任华东，姚小华.樟树种子性状产地表型变异研究[J].江西农业大学学报，2000，22（3）：370-375.

[14]李芳，金志农，黎祖尧，等.樟树种子性状及对生境因子的响应[J].江西农业大学学报，2017，39（1）：92-100.

[15]钟永达，袁凡，孟伟伟，等.材用樟树遗传变异与苗期选择[J].南昌大学学报（理科版），2016，40（2）：197-204.

[16]COLLINS T.ImageJ for microscopy[J].Biotechniques，2007，43（1）：S25-S30.

[17]SCHMUCK M，TEMME T，HEINZ S，et al.Automatic counting and positioning of 5-bromo-2-deoxyuridine （BrdU） positive cells in cortical layers of rat brain slices[J].Neurotoxicology，2014，43（3）：127-133.

[18]GRISHAGIN IV.Automatic cell counting with ImageJ.Analytical biochemistry，2015，473：63-65.

[19]王兰芬，武晶，王昭礼，等.普通菜豆种质资源表型鉴定及多样性分析[J].植物遗传资源学报，2016，17（6）：976-983.

[20]王俊杰，魏晓兰，赵亚萍，等.铅笔柏种子大小变异的初步研究[J].甘肃林业科技，2008，33（4）：24-33.

[21]郝海坤，黄志玲，彭玉华，等.格木种子大小变异及萌发特性[J].广西林业科学，2016，45（1）：30-34.

[22]刘光华，操国兴，杨金亮，等.连香树种子大小分布及其变异研究[J].安徽农业科学，2008，36：10487-10488.

[23]何亚平，王乐辉，费世民，等.麻疯树单粒种子大小变异性研究[J].四川林业科技，2010，31（1）：1-7.

[24]FASSINA L，MAGENES G，INZAGHI A，et al.AUTOCOUNTER，an ImageJ JavaScript to analyze LC3B-GFP expression dynamics in autophagy-induced astrocytoma cells[J].Eur J Histochem，2012，56（4）：44.

[25]QI W，GUO S，CHEN X，et al.Disentangling ecological，allometric and evolutionary determinants of the relationship between seed mass and elevation：insights from multiple analyses of 1355 angiosperm species on the eastern Tibetan Plateau[J].Oikos，2014，123（1）：23-32.

[26]MOLES A T，WESTOBY M.Seed Size and Plant Strategy across the Whole Life Cycle[J].Oikos，2006，113（1）：91-105.

（责编：张宏民）