灵芝—银杏双向固体发酵抗氧化性优化及活性物质的研究

辛燕花 杨丹 刘阳 白晓静 张铁丹

摘 要：以灵芝菌株作为出发菌株，以银杏叶作为基质，通过双向发酵工程技术，对灵芝菌株的抗氧化性及活性物质进行了研究。通过测定超氧自由基清除能力、还原能力、羟基自由基清除能力对新型菌株的抗氧化性进行了评价，在单因素实验基础上，利用正交实验优化了灵芝—银杏双向固体发酵的最佳条件结果表明：在银杏叶添加量为5g/袋（300g），培养料含水率为70%、灭菌时间90min的条件下，灵芝菌株的还原力达到0.374；活性物质多糖含量为51.60 mg/g，三萜含量为14.42 mg/g，总黄酮质含量为5.76 mg/g，分别是对照的1.98倍、2.02和2.35倍。

关键词：灵芝；银杏；双向发酵；抗氧化性；活性物质

中图分类号 TQ61；TQ929 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0014-05

Study on the Antioxidative Optimization and Active Substances of Ganoderma lucidum and Ginkgo biloba Bi-directional Solid Fermentation

Xin Yanhua1 et al.

（1 Department of Biology，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，China）

Abstract：Using bi-directional solid fermentation technology，Ginkgo biloba for medicinal matrix and Ganoderma lucidum as fermentation strain，the bi-directional solid fermentation conditions were optimized with the antioxidant activity （reducing power，superoxide radical scavenging and OH- scavenging） as the main index through single factor and orthogonal test，and the active materials were measured.Result showed that the optimum fermentation culture conditions were：the amount of Ginkgo biloba 5g/bag （300g），moisture content in medium was 70%，sterilizing time was 90min.In the condition，the antioxidant activity of fermentation medium was the highest，reducing power was 0.374；and the yield of polysaccharide，triterpene compounds and total flavonoids 51.60mg/g，14.42 mg/g and 5.76 mg/g，compared with the control，these active materials were up to 1.98，2.02，and 2.35 times respectively.

Key words：Ganoderma lucidum；Ginkgo biloba；Bi-directional fermentation；Antioxidant activity；Active material

“药用真菌双向发酵工程”是指以药用真菌为发酵菌株，以具有活性成分的各种中药材作为基质，该基质既提供真菌生长所需的营养，又因真菌的分解（合成）而产生新的成分，从而使整个发酵作用具有双向性[1]。双向发酵的产物，同时具备药用真菌和中药材的成分和功效，还可能产生新的性味和功效，通过不同真菌与不同中药材交叉、复合组合可构成大量的组合，产生种类繁多的发酵产物，该发酵产物可作为创新中药材的材料[2]。

灵芝（Ganoderma lucidum）是多孔菌科真菌，灵芝的子实体，俗称灵芝草，仙草、瑞草[3]，是一种食药兼用真菌，具有较强的抗氧化能力。现代药理与临床研究表明，灵芝具有多种功效，包括保肝、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗组织胺释放、抗衰老、抑制HIV-1蛋白酶活性、抑制血管紧张素以及调节血糖等[4-5]。银杏（Ginkgo Liloba L.）是银杏科银杏属植物，俗称白果树，是目前应用最为广泛的中药材之一。大量研究证实银杏叶中含有黄酮和二萜内酯等化学成分，具有抗氧化、抗衰老等作用[6]。近年来，灵芝双向发酵技术的研究进展迅速，魏龙、杨海龙、王林等[7，8]发现在培养灵芝过程中，添加适量的中药材，如黄芪、玄参、当归、党参粉末或其水提取物等，可以有效提高灵芝的抗氧化性。本课题组通过在液体培养基中添加银杏叶粉末发酵灵芝后，发现灵芝菌丝体中的抗氧化性及活性物质明显提高[9]。因此，本研究繼续探索以银杏叶为培养基质在固体发酵条件下灵芝子实体的抗氧化性及活性物质成分，为药用真菌和中药材的双向固体发酵提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与试剂 灵芝购于福建食用菌研究所；银杏叶采摘于忻州师范学院；熊果酸标准品：上海阿拉丁生化试剂有限公司；芦丁标准品：上海阿拉丁生化试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备 立式双层智能精密型摇床（BSD-YX3200）：上海助泰有限公司；数显恒温水浴锅（HH-8）：力辰科技有限公司；离心机（TG-16B）：昊天仪器有限公司；台式真空冷冻干燥机（Scientz-10N）：宁波新芝仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS）：上海申安有限公司；紫外可见分光光度计（721-100）：上海菁华仪器有限公司。

1.2 最适发酵单因素试验

1.2.1 样品处理 将新鲜的银杏叶，放置在真空冷冻干燥机中，冷阱温度-40℃、真空度20Pa、加热板温度10℃。冷冻干燥8h，质量不变，粉碎备用。

1.2.2 银杏叶影响因子 以基础培养料（棉籽壳98%，蔗糖1%，石膏1%）装袋，每袋含量300g，分别加入银杏叶5、10、15、20、25g，各3组平行实验，28℃避光培养，待灵芝子实体成熟时，测定子实体的抗氧化性。

1.2.3 基质含水率影响因子 以确定的最佳发酵培养基质银杏叶的量为基础配料，设置培养基的含水率为55%、60%、65%、70%、75%五个梯度，121℃，灭菌2h，28℃避光培养，各3组平行实验，待灵芝子实体成熟时，测定子实体的抗氧化性。

1.2.4 基质灭菌时间影响因子 以确定的最佳发酵培养基质银杏叶的量为基础配料，以最适含水量浸泡过夜，拌匀装袋在121℃下分别灭菌30、60、90、120min，各3组平行实验，28℃避光培养，待灵芝子实体成熟时，测定子实体的抗氧化性。

1.3 最适发酵条件正交实验 在单因素实验的基础上，采用正交实验表L9（33）对发酵银杏量、基质含水量、基质灭菌时间进行3因素3水平的正交实验（表1），每个实验处理进行3次重复。正交实验所得发酵产物以其还原力为指标，进行极差和方差分析，确定最佳发酵条件。

1.4 抗氧化活性的测定 能力测定参照文献进行[10]。

1.5 活性物质的测定 多糖的提取参考文献[11]进行，以葡萄糖标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：y=0.3277x-0.0052，R2=0.9991。

总三萜的提取参考文献[12]进行，以熊果酸标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：y= 5.894x-0.0105，R2=0.9992。

总黄酮的提取参照文献进行[13]，以芦丁标准液的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线：y=1.7492x+0.0102，R2=0.9997。

1.6 统计学分析 采用SPSS Statistics 21软件对数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素条件确定

2.1.1 接种银杏叶因素 通过在培养料中添加不同含量的银杏叶基质，考察灵芝子实体的抗氧化性能力，结果如图1所示。从图中可以看出，银杏叶基质含量对灵芝子实体的抗氧化性有一定的影响，添加银杏叶的含量为10g/袋时，发酵后灵芝菌丝体的抗氧化性最高，为最佳添加质量浓度。

2.1.2 培养料含水量因素 通过测定培养料中不同含水率对发酵后灵芝子实体的抗氧化性能力，发现含水率对灵芝子实体的抗氧化性能力有一定的影响。在灵芝子实体形成过程发现，含水率在65%、70%、75%这3个梯度之间时，菌丝满袋形成子实体的速度要明显高于含水率为55%和60%。从图2可以看出，随着培养料含水率的不断增加，灵芝菌株的还原力、超氧自由基清除能力和羟自由基清除能力都表现出先升高后下降又升高的现象。在含水率为65%时，各项指标都达到最大值，选取含水率为65%时作为发酵培养的最适含水量。

2.1.3 最适灭菌时间因素 对灵芝银杏双向固体发酵的最适灭菌时间进行分析，结果如图3所示。灭菌时间也是影响灵芝子实体抗氧化能力的一个重要因素。灭菌时间为90min时，发酵后灵芝菌丝体的抗氧化性最高，为最佳添灭菌时间。

2.2 正交实验结果分析 基于单因素所得的最佳条件，采用正交表L9（34）安排正交试验，试验结果如表2。

从表2可以看出，对灵芝子实体还原力影响最大的是灭菌时间，其次含水率，影响最小的是银杏叶添加量，还原力最大的最优组合是A1B1C2。进一步通过方差分析验证各因素对灵芝子实体还原能力的影响程度，结果见表3。从表3可以看出，对灵芝子实体还原力影响显著的是含水率和灭菌时间

由于正交试验中得出的最佳发酵条件（A3B1C2）和在极差分析结果中得出的最优组合（A1B1C2）不一致，通过实验进行进一步验证。即将含水率60%，银杏叶添加量5g、灭菌时间90min的条件下进行灵芝发酵培养，对所得子实体进行还原力的测定，实验重复3次，测的灵芝子实体的还原力为0.346，低于在正交组合的最大值。因此，选取正交组合中的A3B1C2为发酵的最优组合，含水率为70%，银杏叶添加量为5g，灭菌时间为90min。

2.3 灵芝菌株的活性成分分析 进一步探讨引起发酵体系抗氧化活性变化的原因，在最优条件下，对发酵后灵芝子实体的部分活性成分多糖，总三萜和黄酮进行测定，结果如表4所示。

从表4可以看出，与灵芝原种相比，以银杏叶为基质的双向发酵后灵芝菌株中的多糖、三萜化合物及黄酮含量明显增加，多糖的含量为51.60mg/g，三萜化合物的含量为4.42mg/g，黄酮的含量为5.76mg/g；分别是对照的1.98倍、2.02倍和2.35倍。

3 讨论

本研究通过一定的优化，以银杏叶为培养基质发酵后的灵芝子实体的抗氧化性及部分具有抗氧化性的活性物质含量明显提高。

研究报道，在灵芝发酵过程中，培养料的组成对发酵产物成分的变化有显著的影响[14]。在本研究中，以银杏叶的添加量作为首要的考察因素。结果表明，高浓度的银杏叶添加量会抑制灵芝菌丝体的生长，这与文献报道的研究结果一致[15]，魏龙等研究也表明中药材中的某些成分会抑制真菌的生长发酵[7]。培养基含水率是影响灵芝生长发育的一个重要因素，如果培养基含水率过少，则会导致菌丝生长延缓，产量和品质会大大降低；而培养基含水率过多，则培养基在高压灭菌过程中，降低了培养基内部的透气性，使其缺少氧气，不利于菌丝进一步生长[16]。在本研究中，培养基含水率过低和过高培養下的灵芝菌株的抗氧化性都比较低。培养料灭菌是食用菌栽培中的关键环节之一，培养料灭菌必须彻底，否则会造成杂菌严重污染而影响菌丝的生长发育，甚至不能出菇；而灭菌时间过长，致使培养基中某些成分和中间代谢产物发生变化，从而抑制微生物的新陈代谢作用[17]。在灭菌时间90min时，菌质的抗氧化性能最大，推测原因可能是培养料灭菌时间较短，杂菌没有彻底杀死，影响了灵芝菌株的生长发育，而长时间的高压灭菌，导致培养基中的成分和银杏叶的有效成分遭到了破坏，抗氧化性能下降。

灵芝作为抗氧化性较强的大型真菌，多糖和三萜含量较高，银杏叶中抗氧化物质黄酮的含量较高，为了考察发酵后的灵芝菌株中的活性物质是否来源于二者的双向发酵，在最优发酵条件下进一步测定发酵后的灵芝菌株中的多糖、三萜、黄酮。经过银杏叶为基质培养发酵的灵芝子实体中多糖、三萜、黄酮的含量明显增加。探讨引起灵芝子实体中抗氧化性活性物质变化的原因，可能是多种因素的综合作用。首先，在银杏叶作为基质发酵灵芝的过程中，银杏叶中的某些物质促进灵芝中多糖、三萜等抗氧化活性物质的产生；其次，灵芝在发酵过程中产生大量的酶分解银杏组织及细胞壁中的纤维素和木质素等大分子物质，从而有利于银杏多糖、黄酮等物质的析出和游离；另外，在发酵过程中，微生物的生物转化作用可能将其他成分转化为多糖黄酮类物质。

参考文献

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（責编：王慧晴）