木姜叶柯红茶的提取条件优选研究

张亚洲1 马建 黄帅 周福才 王强

摘 要：该研究选用L9（34）正交试验对木姜叶柯红茶的提取条件如加水量、提取次数和提取时间进行了考察，选用三叶苷、根皮苷和多酚作为评价指标进行加权评分方差分析，以探索最佳提取的工艺参数。研究确定提取工艺条件优选为A1B3C2D1，即取红茶5g，加水量为300mL，提取3次，提取时间为20min；按以上条件进行3次验证实验，结果表明，该工艺条件下根皮苷的提取转移率为90.53%，三叶苷的提取转移率为89.97%，多酚的提取转移率为90.69%。该实验提供了对木姜叶柯红茶的提取方法，并验证了方法对提取主要成分的稳定性，为木姜叶柯红茶的开发利用提供参考借鉴。

关键词：木姜叶柯；三叶苷；根皮苷；正交提取；总多酚

中图分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）10-0023-05

Optimization of the Extraction Condition of Mujiangyeke Black-tea

Zhang Yazhou1 et al.

（1School of Pharmacy，Guizhou Institute of Technology，Guiyang 550003，China）

Abstract：To study the boiling method of Mujiangyeke black-tea and find out the best boiling process，the orthogonal experiment was used to select the amount of water，the number of decoction and the time of boiling. The content of phlorizin，trilobatin and the total poly-phenols were selected as evaluation indexs. The boiling conditions were optimized as A1B3C2D1，that is，5 g of Mujiangyeke black-tea，adding water 300，300，300mL，boiling 3 times，boiling time 20，20，20min，respectively. According to the optimization process，the results showed that the transfer rate of phlorizin，trilobatin and total poly-phenols was 90.53%，89.97% and 90.69%，in respectively. It was suggested that boiling should be carried out according to the optimized method and which indicated that the process was stable and feasible.

Key Words：Mujiangyeke black-tea；Phlorizin；Trilobatin；Orthogonal boiling test；Total poly-phenols

木姜葉柯[Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.]为壳斗科柯属植物属常绿乔木，别名甜茶、甜叶子树、胖稠、甜味菜、大叶稠子、甘茶、多穗石柯等[1]。现代研究表明，木姜叶柯中的黄酮类成分主要是根皮苷与三叶苷等二氢查尔酮类，另外还有蛋白质、多酚和水溶性色素类成分[2-3]。木姜叶柯中的二氢查耳酮类成分主要具有降血糖，降血压，降脂及抗过敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并发症的防治中具有独特的效果[4-6]。

木姜叶柯甜茶于2017年6月获得了国家卫计委新食品原料批复，在民间多使用其娕叶经加工而成的代茶饮品。为了使木姜叶柯按红茶在提取后质量能尽量保持一致，本研究拟通过对木姜叶柯红茶的提取加水量、提取次数、提取时间进行正交实验，找出最优的木姜叶柯红茶的提取条件，为木姜叶柯红茶的开发利用提供理论依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料 木姜叶柯红茶（20170801）为广西苷亮健生物技术公司供应，采集于广西南宁市南阳乡木姜叶柯种植基地嫩叶按红茶工艺加工而成（检测含水分为10.04%；根皮苷含量为3.19%，三叶苷含量为23.39%，多酚含量为9.54%）。

1.2 试剂 乙腈（HPLC级，成都科龙试剂有限公司）；甲醇（HPLC级，成都科龙试剂有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；水为娃哈哈纯净水；根皮苷对照品>99%，三叶苷对照品>98%（均购于成都德思特生物技术公司）；没食子酸对照品（购于中国药品生物制品检定所>99.5%），无水碳酸钠（分析纯，秦皇岛市化学试剂厂），钨酸钠（分析纯，天津市大茂化学试剂厂），钼酸钠（分析纯，天津市化学试剂四厂），硫酸锂（分析纯，重庆东方试剂厂）；乙腈（HPLC级，成都科龙试剂有限公司）；甲醇（HPLC级，成都科龙试剂有限公司）；磷酸（分析纯，北京化工厂）；水为娃哈哈纯净水。

1.3 仪器 Agilent1260series高效液相色谱仪，检测器：1260DAD（美国安捷伦科技有限公司）；色谱柱：phenomenex，Gemini，4.6*250mm，5μm，柱号：51234-9（美国菲罗门公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；鼓风FC-881-1型热风循环干燥箱（吴江富成烘箱设备制造有限公司）；BSA124S分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；KQ-300DB型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4D数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；98-1-B电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；TU-1901紫外可见分光光度仪（北京普析通用仪器有限公司）。

2 试验方法与结果分析

2.1 色谱条件与系统适用性试验[8-9] 色谱条件：通过对流动相流速、流动相组分等进行优化，找出较好的色谱分离条件。在流速1.0mL·min-1，A（0.1%的磷酸水溶液）：B（乙腈）进行梯度洗脱（表1），检测波长280nm，在根皮苷浓度：0.125mg·mL-1，三叶苷浓度：0.115mg·mL-1，20μL进样时，根皮苷、三叶苷能够较好的分离，色谱条件符合相关要求（图1、图2、图3）。

2.2 根皮苷、三叶苷标准曲线的制定

2.2.1 根皮苷对照品的制备 精密称取根皮苷对照品25.0mg于20mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得A。标准曲线的制定：分别精密吸取根皮苷对照品溶液A，4、3、2、1、0.5、0.2、0.1mL于10mL容量瓶中，用甲醇释至刻度，摇匀，10μL进入HPLC仪，记录色谱图。

2.2.2 三叶苷对照品的制备 精密称取三叶苷对照品23.0mg于20mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得B。标准曲线的制定：精密吸取不同浓度的三叶苷对照品B，5、4、3、2、1、0.5mL于10mL容量瓶中，用甲醇释至刻度，摇匀，10μL进入HPLC仪，记录色谱图。根皮苷、三叶苷标准曲线的制定结果见表2。由表2可知，根皮苷进样浓度在0.25～5.0μg时呈现较好的相关性，回归方程为C（μg）=0.000603A-0.021，相关系数r=0.9998；三叶苷浓度在0.575～5.75μg时呈现较好的相关性，回归方程为C（μg）=0.00047A-0.041，相关系数r为0.9996。

2.3 多酚的含量测定

2.3.1 磷钼钨酸试液的配制 取钨酸钠100g，钼酸钠25g，加水700mL使溶解，加盐酸100mL、磷酸50mL，加热回流10hr，放冷后现加硫酸锂150g，水50mL和溴0.2mL，煮沸除去残留的溴（约15min），冷却，加水稀释至1000mL，滤过，即得。

2.3.2 对照溶液的配制 精密称取没食子酸对照品25.2mg，置25mL的棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5mL，置100mL的棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液的配制 精密称取样品约100mg，置100mL棕色量瓶中，加水适量，放置30min，振摇，超声处理30min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 总酚测定 精密量取供试品溶液1mL，置25mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1mL，再分别加水11mL，用29%的碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min（以相应的试剂为空白），照紫外—可见分光光度法在760nm的波长处测定吸光度。

2.3.5 標准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分别置25mL的棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1mL，再分别加水11.5mL、11mL、10mL、9.0mL、8mL、7mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30min（以相应的试剂为空白），照紫外—可见分光光度法在760nm的波长处测定吸光度A，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。以溶液浓度C（μg）对吸收值A进行线形回归，得线形回归方程：C=270.877A-8.307；r=0.9995；线形范围：25.2～201.6μg时线性关系良好。

2.4 木姜叶柯红茶的提取条件优化实验 通过选取木姜叶柯红茶5g（根皮苷含量为3.19%，三叶苷含量为23.39%，多酚含量9.54%），分别用300mL水提取6次，每次15min，收集每次滤液，分别精密移取5mL至25mL量瓶中，用水稀释至刻度，采用0.45μm微孔滤膜过滤，得滤液，摇匀，HPLC仪10μL分别进样，每次相关成分含量见表3。由表3可知，提取3次后，根皮苷已转移达到80.88%，三叶苷转移已达到77.85%，多酚转移已达到90.25%。故认为在提取次数上选择3次已较合适。

2.5 正交实验 通过选取木姜叶柯红茶，对其提取时的加水量、提取次数、提取时间进行相关正交实验进行考查，优选最佳提取条件。每次取木姜叶柯红茶（1）5g，影响提取的主要因素有加入水量、提取次数和提取时间，上述3个因素各取3个水平进行L9（34）正交试验见表4，提取溶液备用。

选用根皮苷、三叶苷和多酚作为提取工艺的评价指标，对相关指标用加权评分法进行方差分析。确定根皮苷含量权重0.4，三叶苷含量权重0.4，多酚含量权重0.2；分别以根皮苷、三叶苷和多酚中最高测量值为满分100，其它均通过与最高得分进行换算（每项评分得分为=单项测量值/单项最高值*权重分值）。正交提取试验结果见表5～7。

由表5～7可知，对木姜叶柯红茶中根皮苷、三叶苷和多酚加权评分方差分析结果说明，提取影响因素大小是：提取次数>提取时间>加水量，方差分析结果显示提取次数有极显著性的影响。结合直观分析综合结果考虑，对木姜叶柯红茶最后提取工艺确定为A1B3C2D1，即每次提取加水量为300mL，提取3次，提取时间为20min。

2.6 验证实验结果 木姜叶柯红茶提取方法，既每次提取加水量为300mL，提取3次，提取时间分别为20min，从根皮苷含量、三叶苷含量指标考察，重复平行3次。从根皮苷含量、三叶苷和多酚含量指标考察，结果均重复性较好，根皮苷的提取转移率为90.53%（RSD为2.28%，n=3）；三叶苷的提取转移率为89.97%（RSD为1.72%，n=3）；多酚的提取转移率为90.69%（RSD为1.88%，n=3）。

3 结论与讨论

由于传统茶叶泡制时间上较不统一，饮用者饮用不同时间或泡制次数的茶水其质量存在较大差异。为使开发出的茶饮料每次质量能尽量保持一致和可控，木姜叶柯红茶通过对其提取的加水量（加水量设定为约一杯水的量300～500mL；水温约98～100℃）、提取次数、提取时间进行优化，从而找出最优的使用条件。

现在通过对木姜叶柯红茶的提取条件进行考查，采用根皮苷、三叶苷为指标进行评价，最后确定木姜叶柯红茶提取条件确定为，取红茶5g，加水量300mL量，分别提取3次，每次提取时间为20min时，饮用时保留了较合适的根皮苷、三叶苷和多酚成分。

通過实验中观察发现，木姜叶柯红茶在提取过程中，提取后一般第1次（共6次）最容易变质（20～24h时内）且第1次提取的茶水放冷后下喉时有微涩味（40℃以上饮用可减弱），后面提取的2～6次均在放冷时仍保持有一定的甜味，微涩味减弱，并且不容易变质（一般可放置3～4d）；通过红茶提取5min后发现，在黄酮类成分浸出较少的情况下，可以较大程度除去可能引起变质和微涩味的蛋白质、多酚和水溶性色素等成分。

木姜叶柯一般主要用途为每年4—9月份采集其嫩叶加工成茶的形式叶使用，其黄酮类成分一般认为为根皮苷、三叶苷和根皮素，而根皮素在叶中含量较低，未能同时与根皮苷、三叶苷进行含量分析方法的建立。本研究中选用的根皮苷、三叶苷和多酚作为评价指标进行加权评分方差分析确定木姜叶柯红茶的提取工艺，为其开发利用提供了较好的参考。

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（责编：张宏民）