雪莲花醇提液联合中医煎剂对骨髓间充质干细胞增殖活性的作用

张葆鑫，王兴国，郝廷

内蒙古医科大学第二附属医院创伤一科，内蒙古呼和浩特 010000

间充质干细胞属于干细胞家族成员，属于多功能干细胞，可用于组织器官损伤的修复，临床具有较高的应用价值，为此该院研究雪莲花和单味中药黄芪、淫羊藿、丹参以及复方右归饮煎剂对骨髓间充质干细胞的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

药材和实验动物，药材包括黄芪、淫羊藿、丹参和复方右归饮，其中复方右归饮中包括炒山药、熟地、肉桂和制附子等，实验动物选用雄性成年大鼠，4月龄，体重 （220±16）g。 实验试剂包括淋巴细胞分离液，LDMEM、胰蛋白酶、酶标仪、二甲基亚枫、四甲基偶氮唑盐(MTT)以及戊巴比妥钠。

1.2 方法

1.2.1 醇体液和煎剂配置 取90 g黄芪、27 g淫羊藿、45 g黄芪分别加入冷水浸泡50 min后用大火煮开，文火熬制1 h，最后得到60 mL溶液作为定容溶液，此浓度为大鼠服药浓度的10倍。单味雪莲花制备方法：取5.3 g雪莲花一段，将其剪碎后浸泡在75%的乙醇中1个月，之后用纱布对其溶液进行过滤，将溶液在74℃环境下进行乙醇挥发，直到无明显酒精味，定容体积为60 mL。复方右归饮制备方法：取杜仲、炒山药、熟地和枸杞各18 g，山茱萸、肉桂、炙甘草和制附子各9 g，使用冷水进行浸泡40 min以后用大火煮开，文火熬制，定容体积为60 mL，其浓度为大鼠服药浓度的10倍。将以上醇提液和中药煎剂进行高压灭菌。

1.2.2 含药血清配置 使用浓度为大鼠服药浓度10倍的醇提液和中药煎剂对大鼠进行灌胃，每天进行2次，每次8 h一次，连续实施3 d，在最后一天灌胃1 h后给予腹腔麻醉[2]，并采取心尖血，在2 500 r/min条件下离心25 min，4℃ 过夜，提取血清，使用0.22 μm滤膜抽滤并分装，在56℃下灭火30 min,保存于－20℃备用。

1.2.3 大鼠骨髓间充质干细胞的培养和分离 原代细胞培养6 d后，在细胞生长至80%汇合时进行消化传代，将含有贴壁细胞的培养瓶中培养液吸出，使用PBS缓冲液冲洗2次，使用0.4%的胰蛋白酶3 mL进行消化，持续时间为3～5 min，显微镜下观察细胞状态，当细胞形态开始变圆皱缩后，使用等量的完全培养液将消化停止，并制作成细胞悬液。按照1:2的比例进行传代培养。

1.2.4 醇提液、中药煎剂以及含药血清干预 去浓度为2×105/mL的第3代干细胞接种在96孔板上，培养24 h，吸取上清之后，加入不含血清的DMEM溶液100 μL/孔，培养24 h后，将上去吸取后，加入含有15%的小牛血清液的DMEM 培养液100 μL/孔，然后将丹参、黄芪、雪莲花、淫羊藿和雪莲花醇提液加入进去[4]，雪莲花醇提液浓度梯度为（10-2、10-3、10-4，10-5），70 μL/孔药液，每个浓度放置在5个孔内，将上清液吸取之后加DMSO200 μL/孔，在10 min后通过酶标仪测量OD值，波长显示为492 nm。

1.2.5 检测方法 使用MTT方法进行检测，观察出活细胞的功能和数量。

1.3 统计方法

该次调查涉及数据均输入SPSS 18.0统计学软件进行处理，组间计量资料用（±s）表示，行 t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

醇体液和煎剂的MTT检测结果，丹参煎剂具有抑制细胞增殖的作用，在10-5和10-4浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）,淫羊藿煎剂具有抑制细胞增殖的作用，在10-3和10-2浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）,右归饮煎剂、黄芪煎剂和莲花醇提液在4个浓度组均具有促进细胞增殖的作用（P＜0.01），见表1。

表1 醇体液和煎剂的MTT检测结果对比（±s）

表1 醇体液和煎剂的MTT检测结果对比（±s）

药物 例数 空白对照浓度组10-5 10-4 10-3 10-2黄芪丹参淫羊藿雪莲花右归饮5 5 5 5 5 0.073±0.002 0.193±0.012 0.138±0.014 0.061±0.001 0.065±0.022 0.142±0.016 0.115±0.011 0.137±0.026 0.139±0.020 0.192±0.022 0.119±0.020 0.135±0.014 0.134±0.025 0.184±0.020 0.169±0.012 0.144±0.017 0.175±0.021 0.119±0.006 0.184±0.020 0.186±0.036 0.176±0.014 0.177±0.015 0.138±0.014 0.061±0.001 0.172±0.038

3 讨论

该次调查结果显示黄芪煎剂和莲花醇提液在4个浓度组均具有促进细胞增殖的作用。丹参具有安神宁心、活血化瘀的功效，并且能够促进成骨细胞的分化和增殖，在该次研究中发现丹参煎剂具有抑制细胞增殖的作用，在10-5和10-4浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）。淫羊藿煎剂具有抑制细胞增殖的作用，在10-3和10-2浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）。雪莲花中的有效成分为黄酮，其内含有高丰前素，其能够清除身体内的自由基，改善微循环，改变血流动力学，增加机体免疫力，具有抗疲劳的作用具有强壮筋骨、补肾壮阳的作用也比较明显，右归饮能够促进碱性磷酸酶的活性，使钙沉积，促进成骨的形成，同时也减少了钙质的流失，具有促进骨髓基质干细胞分化成软骨细胞，能够延缓软骨细胞凋亡时间。

综上所述，右归饮煎剂、黄芪煎剂和莲花醇提液具有促进细胞增殖的作用。

[1] 王晓玲,汪涛,汪雅妮,等.当归补血汤载药血清对骨髓基质细胞增殖及细胞因子表达的影响[J].辽宁中医杂志,2011,38(2):363-365.

[2] 古今.当归补血汤中黄芪对小鼠造血功能的影响[J].中国中医基础医学杂志，2009，15(3):215-217．

[3] 岑洁,王怡.温补肾阳法治疗慢性肾衰竭—肉桂、附子和仙灵脾的应用比较[J].上海中医药杂志,2007(12):20-22.