新生期缺氧缺血脑白质损伤大鼠神经元树突和突触损伤

林凌，张更，林巧梅，林清

（福建医科大学基础医学院人体解剖学与组织学胚胎学系，神经生物学研究中心，福州 350122)

随着新生儿重症监护技术的发展，早产儿和极低体重儿的存活率越来越高，临床上脑白质损伤的发病率亦呈增高的趋势。脑白质损伤（white matter injury, WMI）患儿常有脑瘫、智力低下、视力障碍和听觉异常等多种神经系统后遗症，成为亟待解决的临床问题。众多研究表明，缺氧缺血（hypoxiaischemia, HI）是引起脑白质损伤的重要因素[1,2]。我们的前期研究结果亦显示，结扎双侧颈总动脉及缺氧可致新生大鼠脑白质发生损伤，并且缺氧缺血后4周其行为学和认知能力下降[3]，但脑白质损伤大鼠行为学和学习记忆能力下降的具体机制仍未完全阐明。早产儿脑白质损伤的靶细胞是少突胶质前体细胞，主要病理改变为脑白质病变，但越来越多的研究认为大鼠学习记忆能力下降与神经元发育成熟障碍有关[4,5]，并且皮层和海马等脑区是参与学习记忆的重要结构[6]。目前对缺氧缺血脑白质损伤后大鼠皮层和海马神经元变化的报道较少，为进一步明确早产儿脑白质损伤后智力障碍与神经元异常的关系，本实验拟探讨缺氧缺血后4周大鼠皮层和海马神经元数量及树突结构变化情况。

神经元树突是神经元发挥功能的关键部位，神经元树突结构的改变影响神经环路内信息传递，进而导致学习和记忆能力的下降。树突棘是神经元树突上的棘状突起，是学习和记忆活动的物质基础，其结构和功能的完整性对于神经元信息的获得和传递至关重要，树突棘的结构异常可改变突触的功能，从而导致学习记忆及认知缺陷[7]。因此，本实验通过建立缺氧缺血脑白质损伤模型，应用免疫荧光技术检测神经元NeuN和MAP-2的表达情况，应用高尔基染色法观察神经元树突及树突棘结构变化，并应用Western blot法测定Syn表达量的改变，明确脑白质损伤中神经元数量及树突结构的变化情况，为深入研究早产儿脑白质损伤致学习记忆能力下降的机制提供实验依据。

材料和方法

1 实验动物及试剂

新生3日龄SD大鼠24只，雌雄不拘，体重8.00～11.00g，由福建医科大学实验动物中心提供（SCXK(闽)2012-0001）。应用随机数字表法将动物随机分为对照组和WMI组。兔抗大鼠MBP抗体、兔抗大鼠NeuN抗体、兔抗大鼠Syn抗体（美国Abcam公司）；小鼠抗大鼠MAP-2抗体（美国ABclonal公司）；Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor555标记的山羊抗兔IgG（美国Invitrogen公司）；DAPI（瑞士Roche公司）；小鼠抗大鼠GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG及免疫印迹相关试剂（碧云天生物技术研究所）。

2 缺血缺氧脑白质损伤模型的建立

参照本实验室原有方法[3]稍加改进。无水乙醚麻醉大鼠，消毒，作颈腹侧正中切口，长约0.5cm；分离双侧颈总动脉，结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤；术后于37℃水浴箱内放置10min，待体温和活动恢复正常，返笼饲养2h后，将大鼠置于XF-XC06-I型低压氧仓全自动控制仪（南京柏曼信息科技服务中心）以8%的氧气缺氧30min。对照组大鼠仅分离双侧颈总动脉，不予结扎及缺氧。

3 标本制备

缺氧缺血后4周分别取对照组和WMI组大鼠各6只。动物用10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉，经左心室插管灌注生理盐水，待流出清亮液体后继续以4%多聚甲醛灌注，待大鼠四肢完全僵直后断头取脑，冰冻切片行免疫荧光染色。

4 免疫荧光染色

脑组织冰冻切片（片厚25μm）后行漂片染色。以免疫荧光显色封闭液室温封闭2h；倾去封闭液，分别滴加兔抗大鼠MBP抗体（1∶200）、兔抗大鼠NeuN抗体（1∶200）和兔抗大鼠Syn抗体（1∶200）、小鼠抗大鼠MAP-2抗体（1∶200），4℃孵育过夜；用0.01mol/LPBS清洗后，滴加AlexaFluor555标记的山羊抗兔IgG（1∶200）、AlexaFluor488标记的山羊抗小鼠 IgG（1∶200），37℃ 孵育 2h；DAPI（1mg/L）染核5min，抗荧光淬灭封片剂封片。激光扫描共聚焦显微镜（德国徕卡，Leica sp8）下观察，绿色激发波长为488nm，发射波长为500-530nm；红色激发波长为552nm，发射波长为570-600nm；蓝色激发波长为405nm，发射波长为420-450nm。阴性对照组以PBS代替一抗进行染色。

用激光扫描共聚焦显微镜图像分析系统计数NeuN阳性细胞数。每只大鼠取3张切片，每张切片于皮层和海马分别选择3个高倍视野（40×）进行细胞数量计数。

5 高尔基染色

用10g/L重铬酸钾、10g/L氯化汞、8g/L铬酸钾配制高尔基液，避光于室温储存5天备用。取HI后4周对照组与WMI组大鼠各3只，用10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉后，0.01mol/L PBS灌注至清亮后用续以0.5%多聚甲醛灌流，断头取脑。脑组织置于高尔基液中，37℃温箱中避光3d。30%蔗糖溶液脱水，4%琼脂包埋，振动切片(200μm)，室温晾干，过夜后染色，中性树脂封片，显微镜下（德国蔡司，Primo Star）观察。

6 Western blot分析

缺氧缺血后4周分别取对照组和WMI组大鼠各3只，共6只。以细胞裂解液裂解大鼠脑组织（包含皮质和海马）后用超声细胞破碎仪匀浆，BCA法测定蛋白浓度，定量后取每孔上样量50μg蛋白，SDSPAGE凝胶电泳，湿转于PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，加入兔抗大鼠Syn抗体（1∶1000，4℃孵育过夜）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶1000，室温孵育2h），洗膜后进行化学发光、显影和定影，生物分子成像仪（日本，LAS 4000 mini）成像。以GAPDH作为内参蛋白。用ImageJ2.1图像分析系统进行光密度分析，以各组目的蛋白与内参蛋白光密度值计算相对比值。

7 统计学分析

所有数据均用均值±标准差（±s）表示。采用SPSS l9.0统计软件对结果进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 缺氧缺血后脑白质损伤

缺氧缺血脑白质损伤主要病理表现为髓鞘合成障碍，脑白质变疏松甚至软化。MBP作为少突胶质细胞的标志物之一，是髓鞘重要成分，可作为髓鞘损伤的标志。缺氧缺血后4周，对照组脑白质MBP免疫反应阳性物排列整齐、致密、突起较长（图1A）；而WMI组MBP免疫反应阳性物较相应对照组减少，排列较紊乱、稀疏、突起变短（图1B），提示脑白质损伤。

图1 免疫荧光检测缺氧缺血对脑白质MBP水平的影响。A, 对照组；B, WMI组；cc，胼胝体；比例尺，50μmFig.1 The effect of hypoxia-ischemia on MBP level in brain white matter evaluated by immunofluorescence staining.A, control group; B, WMI group;cc, corpus callosum; scale bar, 50μm

2 缺氧缺血后神经元数量无变化

缺氧缺血后4周，免疫荧光染色结果显示，NeuN表达于神经元胞体；细胞计数统计显示，对照组和WMI组皮层和海马神经元数量均无明显改变（图2）。

3 缺氧缺血后神经元树突损伤

免疫荧光染色显示，MAP-2表达主要位于皮层和海马神经元的树突和胞体，对照组突起细直而平滑，染色均一（图3左列）；WMI组突起则弯曲、断续（图3右列）。高尔基染色标记神经元胞体和突起，高倍镜下可见神经元树突棘；与对照组相比，WMI组树突棘数量减少（图4）。

4 缺氧缺血后突触素表达减少

缺氧缺血后4周，免疫荧光检测显示，Syn表达于皮层和海马细胞胞质，成颗粒状分布。免疫荧光与Western blot分析均显示，WMI组Syn表达量显著减少（图5）。

讨 论

本研究通过永久性结扎双侧颈总动脉联合缺氧法致使新生大鼠发生缺氧缺血脑白质损伤，应用免疫荧光组织化学染色法检测脑白质MBP和神经元NeuN、MAP-2和Syn的表达，高尔基染色观察神经元树突棘变化，采用Western blot法检测Syn在脑内的变化。我们发现，新生期大鼠发生缺氧缺血脑白质损伤后4周神经元数量未见明显缺失，但其树突损伤，树突棘数量减少，突触减少，从而导致神经元之间联系减少。

图2 缺氧缺血对神经元数量的影响。A, 神经元数量的NeuN免疫荧光染色检测（DAPI复染）.CX，大脑皮质；HP，海马；比例尺，50μm；B，大脑皮质（上）和海马（下）神经元数量统计分析；P＞0.05Fig.2 Effect of hypoxia-ischemia on the number of neurons.A, immunostaining of NeuN (red) positive neurons in cerebral cortex (CX, upper) and hippocampus (HP, lower); DAPI counter-stained nucleus (blue); scale bar, 50μm; B, statistical analysis of NeuN positive neuron counts in CX and HP; P＞0.05

缺氧缺血脑白质损伤为早产儿脑损伤的常见类型，主要病理表现为髓鞘合成障碍。本研究结果显示，缺氧缺血后WMI组大鼠MBP表达量下降，纤维排列紊乱、稀疏，提示缺氧缺血后出现脑白质病变。对缺氧缺血脑白质损伤大鼠进行神经元NeuN免疫荧光染色显示，WMI组皮层和海马神经元数量未发生显著改变。Misumi等[8]的研究结果表明，缺氧缺血早期，大量晚期少突胶质前体细胞发生凋亡，但未见明显神经元凋亡。Pierson[9]等对脑白质损伤患儿研究中亦发现其神经元数量没有减少。缺氧缺血脑白质损伤时虽未观察到神经元数量发生明显改变，那么神经元结构是否发生异常？由于树突是神经元接收、加工和整合输入信息的基本部位，我们重点观察了树突结构的变化。

MAP-2是一种微管相关蛋白，可作为神经元的标志蛋白，在大鼠神经元中表达丰富，主要存在于神经元的胞体和树突中。MAP-2是细胞内信号传导的重要环节，参与神经元的生长和损伤后修复过程，是神经细胞受损及再生指标之一[10]。MAP-2免疫荧光染色结果显示，对照组突起细直而平滑、染色均一，WMI组突起则弯曲、断续，提示神经元树突损伤。Dean[11]等研究发现，缺氧缺血可致皮层锥体神经元树突减少，并认为这可能与大脑损伤后神经元成熟过程受影响有关。树突棘是树突分支上常见的棘状兴奋性突触，在动物的生长发育过程中，学习能力增强，神经元树突长度和树突横截面均显著增大；学习能力下降时，又转而降低[12]。而高尔基染色法是公认的最传统和有效的神经系统形态研究的方法[13]。本研究应用高尔基染色法观察缺氧缺血对神经元树突棘的影响，我们发现WMI组树突棘数量减少。陈元寿[14]等研究亦发现脑缺血再灌注损伤导致树突形态改变和树突棘丢失，尤其是海马内树突棘脱落及消失，可能是脑缺血后患者认知功能障碍的主要原因。由此说明神经元树突棘缺失可能影响学习记忆能力。

突触是实现神经元信息传递的重要结构，与认知损害联系密切[15]。Syn是突触囊泡膜上的一种钙结合蛋白，与突触结构和功能密切相关。Syn不仅参与Ca2+依赖性的神经递质释放，还参与神经元间信息传递，既是突触发生的标志，又是突触传递效能水平的反映[16]。此外，Syn作为突触重塑的特异性分子标志物，与突触的形成及维持突触的稳定有关[17]，可准确反映突触的分布和密度。我们的免疫荧光与Western blot结果均显示，WMI组Syn蛋白表达量减少，提示突触减少。Balakrishnan等[18]研究认为，炎症可致早产儿神经元发育障碍，造成神经元树突和树突棘数量减少，Syn表达量下降，突触间传递减少。

图3 MAP-2免疫荧光检测缺氧缺血对脑组织树突结构的影响。CX，皮层；HP，海马；对照组中箭头示突起细直而平滑；WMI组中箭头示突起弯曲、断续；比例尺，50μmFig.3 MAP-2 immunostaining to visualize dendritic morphology affected by hypoxia-ischemia.CX, cerebral cortex; HP, hippocampus; arrows point to dendrites that are straight and continuous in control group, while bent and fragmented in WMI group; scale bar, 50μm

图4 高尔基染色检测缺氧缺血后神经元树突棘变化。箭头示神经元树突棘；比例尺，10μmFig.4 Golgi-Cox staining to investigate the effect of hypoxia-ischemia on dendritic spines.Arrow indicates dendritic spines; scale bar, 10μm

0～2 岁是儿童神经系统发育的重要时期，WMI患儿认知和行为学障碍通常在幼儿期才明显固定化，而出生后4周大鼠在神经发育上相当于2周岁儿童[19]。我们的研究结果总体显示，新生大鼠缺氧缺血后4周神经元的数量未发生明显改变，但其树突损伤，树突棘数量减少，且突触素减少，说明此时神经元间传递减少，可因此导致学习记忆能力下降。早产儿脑神经元尚未发育完全，缺氧缺血影响神经元进一步发育成熟[20]，其具体机制有待进一步研究。Werhahn等[21]研究发现脑缺血损伤后突触可发生可塑性变化，在很大程度上，突触的可塑性反映了神经系统回路的可塑性。研究认为大鼠神经元发育高峰期为生后7 天之内，一般认为第5天是神经元发育的高峰期并开始形成功能性突触连接[22]，有效调节这种可塑性变化将有助于脑损伤后神经功能恢复，神经元树突棘和突触的可塑性研究有助于为治疗新生儿缺氧缺血脑白质损伤提供新思路。

图5 缺氧缺血对脑组织Syn表达的影响。A, 免疫荧光检测；CX，皮层；HP，海马；比例尺，10μm；B1, Western blot检测；B2， Western blot检测结果的统计学分析；*，与对照组相比，0.01＜P＜0.05Fig.5 Effect of hypoxia-ischemia on Syn expression.A, immunostaining of Syn (Red).Nucleus counter-stain (Blue); CX, cerebral cortex; HP, hippocampus; scale bar, 10μm; B1, representative western blot results; B2, statistical analysis of Western blot.*, compared with control, 0.01＜P＜ 0.05

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