一种石蜡组织切片在载玻片上精准定位的方法

李明显，杜志华，何青莲，李晓，何丽斯，郑广娟

（广东省中医院病理科，广州，510120）

常规石蜡切片过程中，传统的捞片操作只需将组织切片粘贴于载玻片的适当位置即可，并没有对组织的方向和具体位置做明确要求，因此，同一组织蜡块制得的多张连续切片的组织之间存在不同的角度及位置差异，制片效果在一定程度上降低了病理医生阅片的工作效率。 严格规范地限定切片上的组织方向和相对位置就可以使连续切片的制片效果趋于一致，进而可以提高病理医生阅片的工作效率。通过对包埋模具和载玻片进行改进，并按照相应的操作规则就能使同一组织蜡块的多张连续切片在载玻片上的粘贴方向相对统一、粘贴位置相对固定，将这种方法应用于免疫组化和特殊染色等技术的切片制作可以使病理医生的阅片工作更加便利。

材料与方法

1 材料

标本来源于广东省中医院临床科室送检的阑尾、胆囊和肠壁等小组织。

2 实验设备

常规石蜡切片包埋模具（20mm×20mm、江苏世泰），载玻片（25mm×75mm、江苏世泰），石蜡包埋机（Thermo，美国），石蜡切片机（Leica，德国），摊片机（Leica，德国），显微镜（OLYMPUS BX51，日本）

3 实验分组与方法

对照组和改进组均包含阑尾，胆囊和肠壁小组织各一例。

传统方法：将脱水完成的标本分别用包埋模具进行石蜡包埋（图1A1），并对制作好的组织蜡块进行石蜡切片，将切得的多张连续合格的石蜡切片放入摊片池内，然后将展平的组织切片分别捞至载玻片上（图1B1），该组作为对照组。每例标本制作36张切片并依次编号，烤片后进行HE染色。

改进方法：将脱水完成的标本分别用改进包埋模具进行石蜡包埋（图1A2），并对制作好的组织蜡块进行石蜡切片，将切得的多张连续合格的具有缺角标记的石蜡切片放入摊片池内，在载玻片上标记多个标准“T”字符号，等距离分布在载玻片长边的两侧。捞片时，根据组织切片的缺角标记统一组织切片在载玻片上的粘贴方向，固定以某一“T”字符号作为参照物，然后将展平的组织切片分别捞至载玻片上（图1B2），该组作为改进组。每例标本制作36张切片并依次编号，烤片后进行HE染色。

分别选取每例标本的第一张切片在显微镜下进行观察，在低倍镜下选择目标区域后记录切片的位置并固定显微镜的切片夹，然后依次对每例标本的其余切片进行观察，并记录目标区域定位所消耗的时间（即目标区域定位耗时），及相对于第一张切片的方向和位置关系。

图1 包埋模具和载玻片改进前后的示意图。A1，传统包埋模具示意图；A2，改进包埋模具示意图；B1，传统载玻片示意图；B2，改进载玻片示意图Fig 1.Illustration of the embedding mold and mounting slide before and after improvement.A1, conventional embedding mold; A2, improved embedding mold; B1, conventional slide; B2, slide after improvement

4 统计学分析

采用SPSS22.0统计软件，粘贴方向、粘贴位置及目标区域定位的耗时差异在组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

为了明确在HE染色技术中改进包埋模具和改进载玻片的使用规则能否制作标准规范的HE切片，我们记录了每例组织的HE染色切片相对于第一张切片的角度和位置差异（图2），以及在低倍显微镜下定位同一组织相同目标区域（图3）所消耗的时间（即目标区域定位耗时）。结果显示：与同组第一张切片相比，改进组的切片方向和粘贴位置均完全吻合，符合率均为100%，而对照组的切片方向和粘贴位置符合率均显著低于改进组。此外，改进组在低倍显微镜下定位同一组织相同目标区域的耗时均显著低于对照组（表1）。这些结果提示改进后的包埋模具和改进后的载玻片使用规则不但能够满足病理医生对切片的制作要求，而且能够显著提高病理医生阅片的工作效率，可以更好地服务于临床病理诊断。

讨 论

常规石蜡包埋HE染色切片质量的基本标准[1]中没有对组织的方向和具体位置做明确要求，其他病理技术切片质量标准也缺乏具体的规范要求，而制片效果在一定程度上会影响病理医生阅片的工作效率。尤其是应用免疫组化技术[2,3]对乳腺导管内癌及甲状腺微小乳头状癌进行诊断时，及应用特殊染色技术对肾脏穿刺组织进行诊断时，病理医生需要对显微镜上的切片进行前后左右地不断调整，必要时会在载玻片上进行相应的标记以方便再次观察，而标记后的盖玻片若发生移位或标记符号变淡或被擦除，都会造成标记失败。

图2 传统方法和改进方法制片效果比较。A1-A3，分别显示阑尾组织，胆囊组织和肠壁小组织应用传统方法的HE染色制片效果；B1-B3，分别显示阑尾、胆囊和肠壁应用改进方法的HE染色制片效果Fig.2 Comparison of slides prepared by conventional or new methods.A1 to A3, HE-staining of appendix, gallbladder and intestinal wall tissue slices prepared using conventional approach; B1 to B3, HE-staining of same tissue slices prepared using new method.

表1 对照组与改进组三种组织HE染色制片效果比较Tab.1 Comparison on the HE stain of three different tissue slices prepared by conventional and new methods

图3 传统方法和改进方法所制切片的HE染色显微图像比较。A1-A3，分别显示阑尾，胆囊和肠壁应用传统方法的HE染色效果；B1～B3，分别显示阑尾、胆囊、和肠壁应用改进方法的HE染色效果；比例尺，300μm；箭头示目标区域Fig.3 Comparison of HE-stained slides prepared by conventional and new methods.Images for HE-stained appendix (1), gallbladder (2) and intestinal wall (3).Slides A1-3 were prepared using conventional method and B1-3 by new method.Arrows pointed to the target areas.Scale bar, 300μm

为了满足病理医生对切片制作的要求，尤其是同一组织蜡块进行多张连续的免疫组化切片制作时，捞片过程中技术员通常会根据经验来统一组织切片的方向及粘贴位置，使制作的切片趋于规范一致。由于组织切片在水面上呈透明状态，而且组织切片很容易在水面上发生旋转和漂移，又由于载玻片上缺少明确的参照物，实验结果表明：应用传统方法同一组织蜡块制得的多张连续切片容易形成0～180°的角度差异和不同的相对位置移动，形状规则的胆囊组织制片效果差异较小，而较小的肠壁小组织制片效果差异更明显。组织切片在缺少明显标记的情况下，其方向辨识和位置判断比较困难，虽然通过对组织蜡块削角处理可以使组织切片上均呈现明显相同的标记部位，但是不规范的削角操作可能会影响切片质量及制片效果，因此，仅凭借个人经验进行捞片操作是无法制作标准规范的切片[4]。

图4 改进方法在免疫组织化学技术中的应用。A，乳腺癌组织应用改进方法的免疫组织化学染色效果；B1-B8，分别显示乳腺癌组织SMMHC、GATA-3、P120、E-Cadherin、Ki-67、CerbB2、PR、ERa的免疫组织化学染色显微摄影效果；B1细胞质染色阴性，B2、B5、B7、B8细胞核染色阳性，B3和B4细胞膜与细胞质染色阳性，B6细胞膜染色阳性；比例尺，300μmFig.4 Application of new method in IHC techniques.A, IHC staining of breast cancer tissue with new method.Microscopic images of IHC stained breast cancer tissues∶ B1) SMMHC; B2) GATA-3; B3) P120; B4) E-Cadherin; B5) Ki-67; B6) CerbB2; B7) PR and B8) ERa.Negative cytoplasm stain in B1 and positive nuclear stain in B2, B5, B7 and B8; Positive cell membrane and cytoplasm stain in B3 and B4; Positive cell membrane stain in B6;scale bar, 300μm

改进方法通过对传统包埋模具进行缺角设计，利用改进包埋模具进行石蜡包埋时，无需额外的操作就能使制作出的每个组织蜡块均具有明显的缺角结构，对该组织蜡块进行切片后也能得到具有明显缺角标记的组织切片，进而能够较容易地统一同一组织多张连续切片的方向；改进方法在载玻片上设计标准的“T”字符号为组织切片的粘贴位置提供清晰准确的参照物，固定以某一“T”字符号作为参照物，就能使同一组织的多张连续切片在载玻片上的粘贴位置相对固定。本实验用两种不同的方法对同一组织蜡块的多张连续切片进行HE染色切片制作，实验结果表明，不管组织形状是否规则，或者大小如何，按照改进方法的操作规则进行制片，同一组织的多张连续切片都能达到粘贴方向相对统一，粘贴位置相对固定的制片效果。为了进一步验证改进方法在实际工作中的应用效果，对乳腺癌组织进行了免疫组化染色切片制作（图4），实验结果显示，应用改进方法的免疫组化切片制片效果同样具有粘贴方向相对统一，粘贴位置相对固定的特点，同理，改进方法应用于特殊染色技术同样能得到相同的制片效果。因此将改进方法应用于同一组织进行多张连续切片的病理技术中，病理医生在显微镜下对第一张切片的目标区域进行定位后，其余切片均只需要更换至第一张切片的相同位置就能在相同的视野内得到目标区域，从而可以对相应切片做出快速判断，极大得节省了病理医生的时间和精力，而且该优点的发挥不限医院、不限医生、不限显微镜、不限组织、不限染色方法。若要达到预期的制片效果，还需注意以下几点：①载玻片上的“T”字符号要规范统一，同时载玻片需具有一定的粘附性，防止捞片及烤片过程中组织在载玻片上发生位置移动。②捞片动作要迅速，防止含较多脂肪的组织切片因停留在温水中的时间过长而发生膨胀，进而改变组织切片中作为参照物的形状结构。在改进方法操作规则的基础上，捞片时若能进一步统一不同组织切片的缺角方向，对任一组织蜡块而言，无论是一次制得多张连续切片，还是以后多次制片，即使在没有该组织蜡块的第一次切片可供参考的情况下，按照改进方法的操作规则也能较容易地制作出与第一次的制片效果具有相同的粘贴方向和粘贴位置的切片，而且可以与第一次切片中的组织结构进行定性、定量比较，为准确的病理诊断提供依据。

包埋模具的缺角设计与载玻片的“T”字符号相结合使制作标准规范的切片更加容易，与传统方法相比，改进方法并没改变技术员的工作方式，也没有增加技术员的工作量。当同一组织蜡块需要进行多张连续切片的免疫组化或特殊染色（尤其是肾脏穿刺组织特殊染色）时，应用改进方法不但能够满足病理医生对切片制作的要求，而且可以提高病理医生阅片的工作效率,是一种值得推广的新型技术方法。

[1]中华医学会.临床技术操作规范-病理学分册.北京：人民军医出版社，2004，6.

[2]张璋，唐平.免疫组化在乳腺病理诊断中的应用.诊断病理学杂志，2018，25（4）：311-315.

[3]张卫琴.免疫组化技术在病理诊断中的应用.安徽医药，2012，16（11）：1700-1702.

[4]张晓婷，杨佩浓.影响病理切片制作的常见因素分析.临床与实验病理学杂志，2017，33（6）：698-699.